一氧化氮的发现历程

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摘 要：一氧化氮，曾经的大气污染物，现在是细胞间的信号分子；硝酸甘油，曾经的炸药，现在是心血管特效药。这得益于三位美国药理学家（Furchgott，Ignarro和Murad）的重大发现，他们因此获得1998年诺贝尔医学奖。回顾其发现历程，不禁感叹他们“让实验说话”的精神和巧妙的实验设计思路。

关键词：一氧化氮； 发现历程； 硝酸甘油； EDRF

中图分类号：G633.8 文献标识码：A 文章编号：1006-3315（2013）11-026-001

1.背景

1953年Furchgott发表首篇乙酰胆碱（ACh）致兔离体血管条收缩的论文，与当时公认的给动物静注ACh引起血管舒张的观点相反。但因其实验重复性好且观察无误，他坚持己见。

2.质疑

1962年Jellife医生发现并报道在血清素预收缩的血管环上，低浓度ACh导致其舒张，很高浓度ACh才使其收缩。遗憾的是此文章当时并未引起重视，而ACh对非血管平滑肌收缩效应已确定，致使ACh对离体动脉血管作用存在悖论。长达20年一直无人深究或对Furchgott观点提出质疑。直到1978年，Furchgott实验室的一次偶然事件才使这一矛盾得以澄清。

3.转折

技术员David未按Furchgott的实验步骤操作，结果发现拟用于预收缩血管的CCh（ACh类似物）并不使兔主动脉环收缩，相反使其舒张。他向Furchgott抱怨：一定是哪儿出了问题。

4.思考

Furchgott来到实验室仔细检查了实验，他首先注意到David未按他写明的加药顺序进行实验，即在还未洗掉浴槽中去甲肾上腺素（NA）时就加入了CCh，这时血管环处于收缩状态。同时他发现CCh确实总是引起收缩状态的血管环舒张。于是他们一起检查其原因：CCh被NA污染了？可重配的CCh仍使动脉环舒张；用新配的ACh替代CCh加入浴槽，仍是舒张反应。此时他注意到，以往实验用的是螺旋血管条标本，而David采用的是易制备的主动脉环。于是他们开始比较这两种标本制备是否会造成血管反应性的差异。

把对ACh呈舒张反应的血管环取出浴槽、剪成血管条，再挂入浴槽后加入ACh。Furchgott注意到标本制备时干净利落，一次就顺利挂入浴槽的血管条都对ACh呈舒张反应，而对ACh无舒张反应的标本是被反复操作使内膜面受摩擦的血管条。这是他得到的第一个线索：内膜摩擦可能导致血管失去对ACh的舒张反应。

5.深入研究

他们又仔细检查了螺旋血管条的制备方法。Furchgott又惊奇地发现，他们制备血管条过程中，血管内膜面恰好一直搭在手指尖上，且为防止血管条卷曲，又通常是把剪下的血管条内膜面朝下平铺于湿润的滤纸上，再切成长短适宜的血管条。他们立即改进上述方法，不触及内膜面，发现血管条对ACh呈舒张反应。他们把这一发现在当年学术讨论会上作了报告。这是首篇打破ACh悖论、接近于发现血管内皮细胞舒张因子（EDRF）的正式学术报告。

为什么动脉血管内膜面摩擦会导致其丧失对ACh的舒张反应呢？虽然内皮细胞被列入怀疑对象，但当时他首先想到的是机械摩擦造成血管壁细胞损伤，损伤的细胞释放某种酶，使血管平滑肌上“舒张”受体失活。于是他们又走了弯路。

6.小意外

一组织学家的工作险些葬送了他们的发现：Furchgott将呈良好舒张反应和摩擦后不舒张的两种血管环标本送到另一实验室做组织学检查，送回来的两种标本都不含内皮细胞，也就是说，这一结果已排除了内皮细胞在舒张反应中的必要。庆幸的是，半年后一新技术员改进了组织染色方法，终于发现内皮细胞的有无是血管舒张与否的关键。1979年第二篇更接近EDRF的论文摘要投寄至美国药理与实验治疗学会，该论文已明确提出血管内皮细胞与血管反应性有关。

7.灵光一现

为什么刺激内皮细胞可引起血管平滑肌舒张？Furchgott首先想到的是血管内皮细胞受刺激后释放某物质扩散至平滑肌并导致其舒张。他回忆道：那天早晨我刚醒来，一个漂亮的实验设计突然闯入我的脑海。于是我来到实验室，立即按这一方案进行了实验，其结果便是1980年发表于Nature上的著名论文“内皮细胞是ACh诱发动脉平滑肌舒张的必需因素”。

“Sandwich”血管灌流实验 分四步观察不同情况下兔主动脉对ACh的反应：

（1）正常血管环及与内膜摩擦处理后的比较；

（2）正常血管环与胶原酶处理（化学损伤内皮）后相比较；

（3）按照以下要求及顺序实施实验：①横血管条（与管壁平滑肌走向一致）并去内皮；②纵血管条（与平滑肌垂直）含内皮；③将①与②中血管条并列挂在同一个浴槽，内膜面相近且相对；④第③实验完后立即移除②中血管条；

（4）正常血管环，通O2与通N2的比较。

其中（3）的精彩和（4）的出人意料使人印象颇深。（3）中方法是“三明治”血管灌流。（4）中结果明确内皮细胞释放EDRF需O2。

8.NO是EDRF的确证

1979年，Murad从牛动脉血管上取出一块活体进行检验，把按一定比例混合的NO和N2注入活体上。当混合气体通过光滑的肌肉时，肌肉舒张。此结果与硝酸甘油引起的反应相同。硝酸甘油必须代谢为NO才能发挥舒张血管的作用。NO可能是一种对血流具有调节作用的信使分子。

当时这一推测缺乏实验证据。1980年Furchgott发现了一种小分子自由基，能舒张血管平滑肌。几年后，受Murad和Furchgott工作的启发，Ignarro假想EDRF是NO。他利用光谱分析证明了这种假想的真实性并和Furchgott在1986年公布了这一发现。1987年Moncada等在观察EDRF对血管平滑肌舒张作用的同时，用化学方法测定了内皮细胞释放的物质为NO，并据其含量解释了其对血管平滑肌舒张的程度。1988年Polmer等人证明精氨酸是血管内皮细胞合成NO的前体，从而确立了哺乳动物体内可以合成NO。

自此，人们终于了解了硝酸甘油治疗心绞痛的秘密，NO也开始了在生物学以及医学方面的广泛应用，为无数患者带来希望。