R2工程细菌纤维素酶酶活影响条件初探

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摘要：以3，5-二硝基水杨酸（DNS）法测定纤维素酶活力，研究了不同浓度的表面活性剂（Tween 80）、不同缓冲液、不同pH对r2工程细菌纤维素酶酶活的影响。结果表明，在35 ℃、Tween 80浓度为1.6%、醋酸-醋酸钠缓冲液pH 4.8的条件下纤维素酶酶活最高， 是对照的1.47倍。

关键词：纤维素酶；Tween 80；pH；表面活性剂；缓冲体系

中图分类号：Q935 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）18-4486-03

纤维素是地球上数量最大的可再生资源，也是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物[1]。纤维素是经β-1，4葡萄糖苷键连接而成的直链高分子，具有很强的结晶性，糖苷键能通过酶的催化作用发生水解。可以通过纤维素酶系来分解纤维素，使之转变为可被利用的D-葡萄糖，再进一步发酵为酒精，对开发新能源具有重要的意义[2]。

纤维素酶酶解反应过程主要受到温度和pH[3，4]等多方面因素的影响，同时表面活性剂可以使高分子聚合物变成复杂的亲水性化合物，使纤维素与纤维素酶有效结合，从而提高纤维素酶的酶解效率[5-7]。试验将表面活性剂、缓冲液和pH对纤维素酶酶活的影响进行了研究，以期得到纤维素酶适宜的酶解条件，更高效地转化和利用纤维素。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

卡那霉素、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）、羧甲基纤维素钠（CMC）、Tween 80、3，5-二硝基水杨酸（DNS）、苯酚、CuSO4·5H2O、CaCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、葡萄糖均为分析纯；R2工程细菌由重庆理工大学药学与生物实验室提供[8]。

TGL-16M高速台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；UV-2450紫外可见光光度计（优尼科仪器有限公司）；C型玻璃仪器气流烘干器（长城科工贸有限公司）；FE20实验室pH计（梅特勒-托利多仪器有限公司）；BS110S 电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；DZF-6051真空干燥箱（上海越众仪器设备有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 R2工程细菌纤维素酶的分离纯化 将R2工程细菌在LB培养液中培养48 h后经IPTG诱导，将诱导后的培养液于5 ℃、5 000 r/min离心30 min，收集沉淀，往沉淀中加入10 mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH 4.8），超声波破碎（功率300 W，间歇5 s，99次）。取一小滴菌液于载玻片上，草酸铵结晶紫染液染色，显微镜下观察破碎情况，直至无完整细胞。将完全破碎后的菌液装入离心管，5 ℃， 3 000 r/min离心15 min，上清液于-20 ℃保存[9，10]。

1.2.2 纤维素酶的鉴定和酶活的测定 CMC培养基鉴定纤维素酶[11]。DNS法测定纤维素酶活[12]。一个酶活力单位（U）定义为45 ℃、pH 4.8的条件下，每分钟催化CMC水解生成1 μg葡萄糖所需的酶量。

1.2.3 纤维素酶酶活最适缓冲液及pH的确定[12] 用醋酸-醋酸钠缓冲液和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制1%的CMC溶液。在各试管中加入1.5 mL对应的1%的CMC溶液，再加入0.5 mL“1.2.1”中提取的酶液，用2 mL 1%的CMC溶液作对照；40 ℃水浴40 min后立即加入3 mL DNS试剂，沸水浴7 min后加入5 mL去离子水，冷却后测定吸光度。

1.2.4 纤维素酶最适温度的测定 取“1.2.1”中提取的酶液0.5 mL，加入CMC底物1.5 mL，在不同温度（15、30、35、40、45、50、55、60、70 ℃）反应30 min，加入3 mL DNS试剂，沸水浴7 min后加入10 mL去离子水，冷却后测吸光值。

1.2.5 纤维素酶酶活最适Tween 80浓度的确定[13] 取“1.2.1”中提取的酶液0.5 mL，加入CMC底物1.5 mL，再加入0.1 mL不同浓度的Tween 80溶液，45 ℃反应30 min后加入3 mL DNS试剂，沸水浴7 min后加入10 mL去离子水，冷却后测定吸光值。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

根据羧甲基纤维素酶活力测定方法测定溶液中还原糖（葡萄糖）的含量，并以吸光值为纵坐标、葡萄糖含量为横坐标绘制标准曲线（图1）。标准曲线决定系数r2=0.994 8，可以用于纤维素酶活力的测定。

2.2 不同缓冲液及pH对纤维素酶酶活的影响

从图2可以看出，随着pH的升高纤维素酶酶活呈先上升后下降的趋势，合适的pH在4.0～5.5之间，最适pH为4.8，过酸、过碱的环境会影响酶和底物的稳定性，导致纤维素酶活性的降低。醋酸-醋酸钠缓冲液为较适缓冲液。

2.3 温度对纤维素酶酶活的影响

从图3可以看出，R2工程细菌纤维素酶的活性先随着温度的升高逐渐增加，当达到35 ℃时纤维素酶的活力达最大，而后随着温度的升高酶活力下降。故酶活最适温度选择35 ℃。

2.4 不同浓度Tween 80对纤维素酶酶活的影响

从图4可以看出，R2工程细菌纤维素酶酶活在Tween 80浓度为1.6%时达到最大，是对照（无Tween 80和缓冲液体系）的1.47倍。在较低浓度时，随着Tween 80浓度的增加纤维素酶酶活增强。Tween 80可以减弱发酵液的表面张力，纤维素被疏水基团包围，使纤维素高分子聚合物变成复杂的亲水性化合物，从而加强纤维素与纤维素酶的有效结合，提高纤维素酶的酶解效率。当酶活达到最大值后，随着Tween 80浓度的增加，可能使纤维素高分子聚合物被更多的表面活性物质包被，从而减少了纤维素与纤维素酶的接触机会，酶活逐渐降低。

3 小结

试验以DNS法测定了R2工程细菌纤维素酶活力，研究了不同温度、不同浓度表面活性剂Tween 80、不同缓冲液及pH对纤维素酶酶活的影响，结果表明，在35 ℃ Tween80浓度为1.6%、醋酸-醋酸钠缓冲液pH 4.8的条件下纤维素酶酶活最高， 是对照的1.47倍。

表面活性剂能够使大分子聚合物的复杂空间立体结构发生变化，如纤维素是被疏水基团包围，难溶于水，较高的表面活性使纤维素高分子聚合物变成复杂的亲水性化合物，因此，纤维素酶可以方便地吸附底物，从而表现出酶活的增加。但是随着表面活性剂Tween 80浓度的不断增加，会使表面活性剂与纤维素酶之间的电荷积累而相互排斥，也可能因为表面活性剂与纤维素相互吸附降低了酶与底物的吸附从而使酶活下降。

在当今环境污染严重、能源紧缺的情况下，将纤维素酶反应体系扩大应用于工业化生产，把纤维素转化生成葡萄糖或酒精，能够提供重要的工业原料和能源物质，这对开辟新原料、新能源物质具有重要的理论和实践意义。

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