响应面法优化米曲霉α-淀粉酶液体发酵培养基

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[摘要]应用快速有效的响应面分析法对米曲霉α-淀粉酶的发酵培养基进行优化。首先采用二水平Plackett-Burman设计对培养基中的6种成份进行筛选,获得影响产酶的3个重要影响因子:豆粕粉、NaNO3、FeSO4 ;利用响应面分析法对该3因素进行3水平的优化,获得它们的最佳组合(g/L):豆粕粉 25.5、NaNO3 4.08、FeSO4 0.0075。优化后产酶水平达到1107.41U/mL,与响应面数学模型的预测值只有4.02%的误差。

[关键词]α-淀粉酶Plackett- Burman设计响应面分析法

淀粉酶是水解淀粉和糖原的一类酶的总称,广泛存在于动物、植物和微生物中[1]。淀粉酶是生物工艺学中最早实现工业生产的酶制剂品种,用途广,产量大[1]。α-淀粉酶是淀粉酶的一种,其作用于淀粉时,可从分子内部切开α-1,4键而生成糊精和还原糖,产物的末端葡萄糖残基C1碳原子为α-构型,α-淀粉酶因此而得名[1]。α-淀粉酶作为一种重要的工业酶制剂,被广泛地用于食品,发酵,纺织,造纸业,制药业和化学药品工业等工业,此外还扩展到临床,医学,分析化学等其他领域。目前国内主要利用细菌来生产α-淀粉酶,用真菌发酵产α-淀粉酶的研究较少[2]。

本研究报道利用数学统计学法Plackett Burman和响应面法(RSM)[3,4]快速优化米曲霉液体发酵产α-淀粉酶的发酵培养基。

1材料与方法

1.1 菌种

米曲霉(Aspergillus oryzae)FS016,本实验室保藏。

1.2 培养基

斜面培养基(g/L):蔗糖 30、NaNO3 2、K2HPO4・3H2O 1、MgSO4・7H2O0.5、KCl 0.5、FeSO4・7H2O 0.01、麸皮 10、琼脂10,初始pH为6.5,灭菌温度121℃,灭菌时间23 min。

液体发酵培养基(g/L):玉米粉 50、豆粕粉 20、NaNO3 4、K2HPO4・3H2O 3、MgSO4・7H2O1、FeSO4・7H2O 0.01,初始pH为6.5,灭菌温度121℃,灭菌时间23 min。

1.3 培养条件

由斜面接一环至 250 mL三角瓶中,培养基装量 40 mL/250 mL,发酵温度31℃,250rmin-1的摇床上震荡培养84h后,测定α-淀粉酶活力。

1.4 α-淀粉酶活力的测定

YOO改良法[5],酶活定义为:在pH5.0,温度55℃条件下,1 mL的酶液在5min内水解1mg淀粉的酶量为一个活力单位,用U表示。

1.5 发酵培养基优化

1.5.1 Plackett-Burman 设计优化

选取6个因素、试验次数选12的Plackett-Burman设计,重复次数为2次,考查各因素的主效应和交互作用的一级作用,从中筛选出对发酵优化具有显著性影响的因素进行排列,最终获得三个显著性因素。

1.5.2响应面设计优化

根据BOX-Behnken的中心组合设计原理,由Plackett-Burman设计筛选出的3个重要影响因素各取三水平,设计了3因素3水平共15个实验点的响应面分析。

本实验用统计分析软件SAS对实验结果进行分析[6]。

以上所有试验重复次数为三次,每次两个平行。

2结果与分析

2.1 Plackett-Burman 设计筛选培养基主要成分

选用试验次数N=12的Plackett-Burman设计,对6个因素进行考察,分别对应于表1中A、B、D、E、G和H列,每个因素取低水平“-1”和高水平“1”。另设2个虚拟序列,对应表1中的C和F列,以考察试验误差。试验设计与结果见表1。

用SAS软件的二水平设计分析各因素的主效应,结果见表2。各因素对产酶影响顺序为:豆粕粉> FeSO4> NaNO3>玉米粉,利用响应面分析对豆粕粉、NaNO3、FeSO4 3个培养基组分进行更深入的研究。

表1N = 12的 Plackett - Burman的试验设计与结果

实验点 A B (C) D E (F) G H 酶活

(U/mL)

1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 841.48

2 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 733.33

3 -1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 740.19

4 1 -1 1 1 -1 1 -1 -1 936.75

5 1 1 -1 1 1 -1 1 -1 751.30

6 1 1 1 -1 1 1 -1 1 744.00

7 -1 1 1 1 -1 1 1 -1 697.85

8 -1 -1 1 1 1 -1 1 1 716.88

9 -1 -1 -1 1 1 1 -1 1 817.30

10 1 -1 -1 -1 1 1 1 -1 974.55

11 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 744.94

12 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 980.87

(C)、(F):虚拟列

表2各因素的主效应

编码

因素

水平 方差分析

-1 1 F检验 大于|F|值概率Pr > F 重要性排列

A 玉米粉 50 62.5 3.00 0.1438 4

B 豆粕粉 20 25 27.38 0.0034 1

D NaNO3 4 5 5.19 0.0718 3

E K2HPO4 3 3.75 1.36 0.2956 6

G MgSO4 1 1.25 1.90 0.2264 5

H FeSO4 0.01 0.0125 8.74 0.0317 2

2.2 响应面设计优化培养基

将Plackett-Burman设计确定的3个重要因素,即豆粕粉、 FeSO4、NaNO3分别记为X1、X2、X3,以发酵酶活作为响应值,记为变量Y,利用Box-Behnken的中心组合设计,三因素各取3水平列表(见表3),设计了3因素3水平共15个试验点的试验设计,试验设计及结果见表4。

利用SAS统计软件的二次响应面回归(RSREG)进行数据分析,参数值见表5,得到拟合二次回归方程如下:Y=922.139933-5.133875000X1-15.381950000X2-15.933200000X3-44.37449167X1*X1-39.55369167X2*X2+76.29510833X3*X3+9.436200000X1*X2+35.56700000X1*X3+61.25020000X2*X3。

从表4可知,该模型计算出的拟合值与实验值较好吻合,平均拟合误差只有1.29%。该模型可信度分析见表6。从表6可知,二次响应面回归模型是显著,二次响应面回归模型是显著(决定系数R2=0.9288),模型拟合程度较理想,说明这3个因素及其二次项能解释Y变化的92.88%,模型回归P值为0.0210,回归显著,所以该模型可用于米曲霉产α-淀粉酶发酵优化的理论推测。

表3三因素和三水平取值

编码 因素 水平

-1 0 1

X1 豆粕粉(g/L) 20 30 40

X2 NaNO3(g/L) 4 5 6

X3 FeSO4(g/L) 0.0075 0.01 0.0125

表4发酵优化实验 Box-Behnken设计矩阵和响应数据的实测值与拟合值

实验号 因素 酶活(U/mL)

X1 X2 X3 实验结果 拟合值 拟合误差 (r%)

1 -1 -1 0 846.56 868.16 2.49

2 -1 1 0 812.22 818.52 0.77

3 1 -1 0 845.33 839.02 0.75

4 1 1 0 848.73 827.13 2.61

5 0 -1 -1 1072.46 1051.45 2.00

6 0 -1 1 891.37 897.08 0.64

7 0 1 -1 903.89 898.18 0.64

8 0 1 1 967.81 988.82 2.12

9 -1 0 -1 1011.29 1010.69 0.06

10 1 0 -1 901.98 929.29 2.94

11 -1 0 1 935.01 907.69 3.01

12 1 0 1 967.97 968.56 0.06

13 0 0 0 927.77 922.14 0.61

14 0 0 0 921.39 922.14 0.08

15 0 0 0 917.27 922.14 0.53

表5参数估计表

参数 自由度 标准误差 T值 大于|t|的概率 参数估计值

斜率 1 17.2736 53.39

X1 1 10.5779 -1.19 0.2858 -12.6375

X2 1 10.5778 -1.46 0.2050 -15.4000

X3 1 10.5779 -2.22 0.0775 -23.4375

X1* X1 1 15.5702 -3.33 0.0207 -51.8958

X2* X1 1 14.9594 0.63 0.5553 9.4500

X2* X2 1 15.5702 -2.06 0.0945 -32.0708

X3* X1 1 14.9594 1.38 0.2274 20.5750

X3* X2 1 14.9594 4.09 0.0094 61.2500

X3* X3 1 15.5702 4.42 0.0069 68.8042

表6模型方程方差分析表

回归 自由度 平方和 R2 F P(Pr> F)

线性 3 7569.46 0.1204 2.82 0.1467

平方项 3 33762 0.5371 12.57 0.0091

交互项 3 17057 0.2713 6.35 0.0370

总模型 9 58388 0.9288 7.25 0.0210

2.3 培养基最适组合

在获得回归非线性模型和响应面以后,为了求得培养基最适浓度组合,对已回归的非线性模型方程求一阶偏导,并令其等于0,得到了三元一次方程组,得到曲面的最大点。求解此方程组得到最大产酶水平的最佳培养基浓度组合:X1=-0.448(25.5g/L);X2=-0.916(4.08g/L);X3=-1(0.0075g/L),预测值为1064.58U/mL,即产酶水平最高时的最佳培养基组成(g/L):玉米粉 50、豆粕粉 25.5、NaNO3 4.08、K2HPO4・3H2O 3、MgSO4・7H2O 1、FeSO4・7H2O 0.0075,初始pH为6.5。

2.4 回归模型的验证

以该法选出的最适培养基浓度进行发酵试验,发酵水平达到1107.41U/mL,试验值与模型计算值相差+4.02%,可见该模型可以较好地预测实际的发酵情况,说明响应面分析法用于优化发酵培养基是可行有效的[7]。

3结论

对米曲霉F016α-淀粉酶液体发酵培养基进行优化,经Plackett-Burman设计优化确定三因素,并取三水平,根据Box-Behnken设计试验矩阵进行实验得到数据后,进行响应面回归分析得到最佳培养基配方(g/L):玉米粉 50、豆粕粉 25.5、NaNO3 4.08、K2HPO4・3H2O 3、MgSO4・7H2O 1、FeSO4・7H2O 0.0075,初始pH为6.5。

最终酶活力为1107.41U/mL,比初始水平提高了12.54%,α-淀粉酶酶活力有了显著提高,达到实验预期目标。

参考文献:

[1] 张树政.酶工业制剂,下册[M].北京:科学出版社,1998.

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