流感病毒诱导肿瘤细胞凋亡的研究

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[摘要]目的：探讨流感病毒与经紫外线照射后的流感病毒是否具有诱导肿瘤细胞凋亡的能力。方法：流感病毒及经紫外线照射后的病毒分别以20 m.o.i.感染Hela细胞，于不同时间取细胞分别在电镜下观察细胞超微结构的改变， Annexin-VFITC/PI流式细胞仪进行凋亡定量分析。结果：流感病毒作用于Hela细胞后6 h电镜下即可见细胞凋亡的改变。流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡百分率随时间延长而增高，于12～24 h达高峰，流感病毒诱导凋亡百分率最高达40.2%，紫外线照射后的流感病毒最高达16.4%。结论：流感病毒与经紫外线照射后的流感病毒均有诱导肿瘤细胞凋亡的能力，但流感病毒诱导肿瘤细胞凋亡的能力要比经紫外线照射后的流感病毒强。

[关键词]流感病毒；肿瘤细胞；细胞凋亡

[中图分类号]R73[文献标识码]B [文章编号]1673-7210（2007）05（c）-150-02

细胞凋亡是细胞在生理或病理信号刺激下，启动自身凋亡相关基因而发生的主动“自杀”过程。近年来的研究表明，流感病毒可诱导多种细胞发生细胞凋亡，包括其容纳细胞和非容纳细胞，由于流感病毒可诱导多种肿瘤细胞发生细胞凋亡，因此认为这可能是肿瘤治疗的一条新途径。本研究选择了非容纳细胞（Hela细胞），体外观察流感病毒与经紫外线照射后的流感病毒分别诱导其凋亡的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病毒与细胞A型流感病毒购自华西医科大学典型培养物保藏中心， Hela细胞为大连医科大学微生物教研室保存的传代细胞，在含有10%小牛血清的MEM培养基中培养传代。

1.1.2 主要试剂与仪器Annexin-V-FITC/PI Staining试剂盒购自Roche公司。透射电子显微镜(JEM-2000EX)，流式细胞仪(FACS V antage TMSE)，酶标仪(model 3550，biorad公司)。

1.2 方法

1.2.1 病毒培养将A型流感病毒接种于9～11日龄鸡胚尿囊腔，37℃孵育72 ｈ，收获尿囊液，检测血凝效价，取血凝效价>1∶640的尿囊液低温保存备用。

1.2.2 肿瘤细胞凋亡的诱导Hela细胞长至80%单层(悬浮细胞于对数生长期)时，按20 m.o.i.加入病毒液1 ml/瓶[1]，37℃吸附1 h，吸出病毒液，加入含2%小牛血清的维持液继续培养，于诱导后不同时间点收集细胞，以下述方法检测凋亡。同时以生理盐水诱导作为对照。

1.2.3 Hela细胞凋亡的形态学检测将不同时间收集的细胞(约1×108个)，按常规程序固定、脱水、包埋、切片后，经枸橼酸铅、醋酸铀染色后电镜下观察细胞超微结构特征的改变。

1.2.4 Annexin-VFITC/PI染色检测细胞凋亡取效价为1∶64 Ａ型流感病毒0.5 ml接种至长成80%单层的Hela细胞，37℃吸附1 h弃去病毒液，加入维持液1 ml。于接种后4、8、12、24、48 h收集细胞，用冷PBS洗涤两次，调整细胞浓度为1×108个/ml，取100 μl进行染色，流式细胞仪检测细胞凋亡。同时设不加病毒的阴性对照及经紫外线照射30 min的病毒对照。共检测3次结果取均值。

2 结果

2.1 细胞超微结构改变

电镜下可见，生理盐水诱导组细胞染色质疏松，在细胞核内均匀分布，胞浆丰富；而病毒感染组细胞则出现凋亡的形态学改变，诱导后6 h细胞表现凋亡早期改变，诱导后24 h则多数细胞出现凋亡后期形态学特征。在凋亡早期，细胞微绒毛消失，细胞表面平滑化，核浓缩、染色质固缩凝结至核膜周边；随后胞质浓缩，细胞体积缩小，内质网扩张，形成一系列膨胀小泡，胞浆内细胞器(线粒体、溶酶体)聚集，结构完整；最后胞膜逐渐内陷，将细胞分割成多个大小不等的不连续凋亡小体(图1)。

2.2 Annexin-VFITC/PI染色流式细胞仪检测结果

流感病毒及紫外线照射30 min后的流感病毒分别作用于Hela细胞后，于4、8、12、24、48 h收集细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡，按下式计算凋亡百分率。结果病毒感染后6 h开始出现细胞凋亡，且凋亡百分率随时间延长而增高，于12～24 h达高峰，之后凋亡百分率下降，而坏死细胞百分率逐渐增加(凋亡百分率=实测凋亡百分率-阴性对照凋亡百分率)（表1）。

3 讨论

凋亡是不同于坏死的细胞死亡方式之一，它与机体的一些生理与病理过程密切相关。研究表明，细胞凋亡的抑制与肿瘤的发生、发展及其对治疗的耐受都有着密切的关系。由于肿瘤细胞凋亡具有可诱导性，诱导肿瘤细胞凋亡已成为肿瘤治疗的又一途径。中国在20世纪80～90年代即有大量关于用流感病毒治疗小鼠腹水瘤使动物生存期延长的报道[1～3]，笔者认为这与病毒感染肿瘤细胞后，在其表面表达病毒抗原成分，从而增强细胞抗原性，提高机体免疫系统对肿瘤细胞的识别、清除能力有关[1]。鉴于流感病毒能诱导体外培养的细胞发生凋亡，且皮下和腹腔注射并不引起动物发病和死亡，因而有望利用流感病毒诱导肿瘤细胞凋亡开发一种新型的肿瘤治疗方法。在研究中发现，流感病毒不仅可引起动物呼吸道细胞及一些容纳性细胞的凋亡，亦可引起非容纳性细胞(如Hela细胞)发生凋亡[4～6]。本研究选择了非容纳细胞，体外观察流感病毒与经紫外线照射后的流感病毒分别诱导其凋亡的作用。

本研究发现：无论是A型流感病毒还是经过紫外线照射的流感病毒均可诱导Hela细胞凋亡，但流感病毒诱导肿瘤细胞凋亡的能力要比经紫外线照射后的流感病毒强。当A型流感病毒作用于Hela细胞后6 h细胞表现凋亡早期改变,诱导后24 h则多数细胞出现凋亡后期形态学特征。从诱导时间来看，流感病毒作用后6 h开始出现细胞凋亡，12～24 h时的细胞凋亡百分率达到高峰，之后随着坏死细胞增多，凋亡百分率开始下降。与此同时，流感病毒经紫外线照射30 min后作用于Hela细胞,流式细胞仪也同样检测到了一定的凋亡率，最高可达到16.4%，这说明，经紫外线作用后的流感病毒仍然具有一定的诱导细胞凋亡的能力，但其他报道认为紫外线灭活后的流感病毒不能诱导细胞凋亡[7]，对此尚需进一步研究。流感病毒诱导细胞凋亡一方面是其致病的一个重要机制[8～9]，另一方面也提示其在肿瘤的治疗方面可能具有一定的应用价值。

[参考文献]

[1]宁安红,黄敏,吴天靖，等.副流感病毒治疗小鼠腹水型肝癌、小鼠肉瘤S180腹水瘤的实验研究[J].大连医科大学学报,1996,18(3):166.

[2]黄敏,宁安红,张卓然,等.纯化的甲型流感病毒、新城鸡瘟病毒免疫治疗S180荷瘤鼠实验研究[J].齐鲁肿瘤杂志,1996,3(2):100.

[3]黄祯祥,彭通才,李燕,等.病毒治疗小鼠腹水瘤的研究:PR8株流感病毒治疗S180腹水瘤的初步机理探讨[J].中华肿瘤杂志,1985,7(5):32.

[4]Takizawa T,Matsukawa S,Higuchi Y,et al.Induction of programmed cell death(apoptosis)by influenza virus infection in tissue culture cells[J].JGenVirol,1993,74(11):2347.

[5]Hinshawpt VS,Olsen CW,Dybdahl-Sissoko N,et al.Apoptosis:a mechanism of cell killing by influenza A and B virus[J].J Virol,1994,68(6):3667.

[6]ItoT,KobayashiY,MoritaT,et al.Virulent influenza A virus induced apoptosis in chickens.Virus Res,2002,84(1-2):27.

[7]Price GE，Smith H，Sweet C. Differential induction of cytotoxicity and apoptosis by influenza virus strains of differing virulence[J].J Gen Virol，1997，78(11):2821-2829.

[8]Hinshaw VS，Isen CW，Dybdahl Sissoko N，et al.Apoptosis:a mechanism of cell killing by influenza A and B viruses[J].J Virol，1994，68(6):3667-3673.

[9]Ito T，Kobayashi Y，Morita T，et al.Virulent influenza A viruses induce apoptosis in chickens[J].Virus Res，2002，84(1-2):27-35.

（收稿日期：2007-03-08）

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