蒙药制剂“三花散”对小鼠免疫水平影响的研究

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摘要：目的：研究蒙药制剂“三花散”对小鼠免疫水平的影响，进一步探讨蒙药制剂“三花散”的免疫药理机制。方法：常规方法制备蒙药“三花散”醇提液为实验药物，以小鼠为试验动物。通过灌胃法连续给药，观察不同剂量的蒙药制剂“三花散”分别对小鼠淋巴细胞转化率、腹腔巨噬细胞吞噬功能影响，RT－PCR技术检测对免疫分子Fa8配体及穿孔素等表达水平的影响。结果：实验结果表明，蒙药制剂“三花散”：(1)能够提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数，与正常对照组比较差异显著(P＜0.01)；(2)能够促进小鼠体内淋巴细胞的转化与增殖，实验组小鼠的淋巴细胞转化率较正常对照组显著提高(P＜0.01)；(3)实验组小鼠脾脏免疫分子Fa8配体及穿孔素为阳性表达，实验组与对照组比较差异显著(P＜0.01)。结论：蒙药制剂“三花散”不仅能使小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能及淋巴细胞活性增强，并能增强小鼠脾组织免疫分子Fas配体及穿孔素的表达水平，提示蒙药制剂“三花散”能够有效的促进小鼠的免疫功能。

关键词：蒙药；三花散；鼠；免疫功能

中图分类号：R446.63　文献标识码：A　文章编号：1673－7717(2008)07－1416－04

近年来，随着对民族医药研究的深入发展，人们发现许多种药、蒙药、藏药的活性成分及复方都具有很好的免疫调节作用，在一定剂量范围内能增强机体免疫功能，或使紊乱的机体免疫状态恢复正常。蒙药作为祖国医学伟大宝库的重要组成部分，它历史悠久，理论独特，具有显著的地域特色和民族特色，已成为当今世界上抗肿瘤药。或免疫调节药等新药开发的研究热点。蒙药“三花散”出自蒙医经典著作，是由兰花、路路花、白花龙丹组成，具有清热解毒、消肿等功效，用于瘟病、热症等疾病。多年临床试验证明，其有消炎、抗病毒、抗肿瘤的作用，因此推测蒙药制剂“三花散”能调节机体的免疫功能，但迄今对其药用机理研究甚少。本研究以蒙药“三花散”醇提液为实验药物，以小鼠为实验动物，通过灌胃给药，采用免疫学的研究方法，观察了蒙药“三花散”醇提液对免疫功能低下小鼠模型白细胞计数和白细胞分类、淋巴细胞转化率、腹腔巨噬细胞吞噬功能，RT－PCR检测其对免疫分子Fasl(Fas配体)及穿孔素等表达水平的影响。

1　材料

1．1　受试药物及主要试剂

蒙药“三花散”(内蒙古民族大学医学院提供)，醇提液由大连医科大学第二附属医院药剂室制备；环磷酰胺(由江苏恒瑞医药股份有限公司生产)；HanKe液(自配)；RT－PCR反应体系试剂盒(大连宝生物公司提供)；植物血凝素(PHA)(广州市医药工业研究所)。

1．2　实验动物

纯系Balb/c小鼠，体重(20±2)g，雌雄各半，由大连医科大学实验动物中心提供，自然采光，标准鼠饲料和自来水喂养。

1．3　主要仪器

多功能成像系统(Nikon)；RNA检测仪(Bio Rad，Her－cuIes，CA)；低温冷冻切片机、低温离心机(德国Eppendoff公司)；电子天平(上海分析仪器厂)；光学显微镜(OLYM－PUS公司)。

2　方法

2．1　小鼠巨噬细胞吞噬功能检测

采用巨噬细胞吞噬鸡红细胞法。取体重(20±2)g小白鼠40只，雌雄各半，随机分为4组，每组10只。正常对照组，给予生理盐水0.2mL/只，每日1次；阳性对照组，给予腹腔注射环磷酰胺0.05g/kg，每日1次，连续给药7天。实验I组(环磷酰胺加低剂量蒙药组)和实验II组(环磷酰胺加高剂量蒙药组)，在给予环磷酰胺0.05g/kg，每日1次第3天开始分别以0.75g/kg，每日1次和1.5g/kg，每日1次剂量给予蒙药“三花散”醇提液：采用灌胃法连续给药。于第8天各组小鼠均经腹腔注射给予2％淀粉生理盐水溶液2mL，72h后腹腔注射5％鸡红细胞悬液1mL，间隔1h，用颈椎脱臼法处死小鼠。正中剪开腹壁皮肤，经腹膜注入HanKe液2mL，吸取腹腔洗液ImL，分滴于2片载玻片上，置于37~C温箱内孵育30min，进行漂洗、固定、染色、镜检，按下式计算吞噬百分率和吞噬指数。

吞噬百分率=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/观察巨噬细胞总数(100)×100％

吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞数/观察巨噬细胞总数(100)

2．2小鼠体内淋巴细胞转化实验

采用全血形态学检测法。取体重(20±2)g小白鼠40只，雌雄各半，动物分组、给药方法同上2.1。连续给药7天，各组小鼠均在给药第8天，PHA按6mg/kg腹腔注射，每天1次，连续3天。各组在注射PHA前1h给药，每天1次，连续灌胃3天。各组小鼠在给予PHA第4天分别剪尾取外周血推片，瑞氏染色，计数淋巴细胞及淋巴细胞转化率(过渡型细胞列入转化细胞)。

淋巴细胞转化率(％)=转化的淋巴细胞数(过渡型+母细胞)/淋巴细胞总数×100％

2．3　小鼠Fas配体(Fasl)和穿孔素(perforin)mRNA水平表达检测

采用RT－PCR方法，检测小鼠脾组织Fas配体(Fasl)和穿孔索(peffofin)mRNA水平的表达。

2．3．1　动物分组取体重(20±2)g小白鼠40只，雌雄各半，随机分为3组，每组10只。正常对照组：生理盐水0.2mL/只，每日1次；阳性对照组：给予腹腔注射环磷酰胺0.05g/kg，每日1次，连续给药7天；实验组(环磷酰胺加高剂量蒙药组)，在给予环磷酰胺0.05g/kg，每日1次第3天开始以1.5g/kg，每日1次剂量给予蒙药“三花散”醇提液，采用灌胃法连续给药7天。

2．3．2　组织总RNA提取及定量各组小鼠均在给药第8天断颈法处死小鼠，摘取脾脏，提取组织总RNA(按试剂盒说明书操作)。

2．3．3　引物穿孔素(Perfofin)：上游引物5′－ACAGAG－GTTCCTGAGGCCTGA－3，′下游引物5′－ACGGTAGGTCT－GGTGGAAAGA－3′；Fas配体：上游引物5′－TCTGGTG－GCTCTGGTrGGAAT－3′，下游引物5′－GGTCAGCACTGG－TAAGATTGA－3′；β－actin：上游引物5′－CCTAAGGC－CAACCGTGAAAAG－3′，下游引物5′－TCTTCATGGT－GCTAGGAGCCA－3′。

2．3．4　小鼠脾组织Fas配体(Fasl)和穿孔素(perforln)的半定量RT―PCR按照说明书进行操作，RT－PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分离，照相记录。反应重复进行3次。图像扫描，进行半定量分析。

2．4　统计方法

采用SPSS统计学软件对结果进行统计分析。

3　结果

3．1　巨噬细胞吞噬功能的测定

结果见表1。由表1中数据统计分析表明，具有免疫

抑制作用的环磷酰胺能抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，使其吞噬百分率和吞噬指数均明显降低，与生理盐水组有极显著性差异(P＜0.01)；免疫功能低下小鼠给予不同剂量“三花散”醇提液，均能使小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数明显升高，与阳性对照(环磷酰胺)组均有极显著性差异(P＜0.01)。实验I组与实验lI组之间比较亦有极显著性差异。

3．2　对小鼠体内淋巴细胞转化功能的影响

结果见表2。由表2中数据统计分析表明。蒙药制剂“三花散”能显著促进小鼠淋巴细胞转化率，对环磷酰胺抑制小鼠淋巴细胞转化率有明显的促进作用。结果分析发现，具有免疫抑制作用的环磷酰胺，使小鼠淋巴细胞转化率明显降低，与生理盐水组有极显著性差异(p＜0.01)；蒙药“三花散”醇提液能使小鼠淋巴细胞转化率明显升高，与阳性对照(环磷酰胺)组比较均有极显著性差异(P＜0.01)。实验I组与实验Ⅱ组之间比较亦有极显著性差异。

3．3　小鼠脾组织Fas配体(Fasl)和穿孔素(perforJn)基因表达测定

从图1中可见，单纯给予环磷酰胺的小鼠Fas配体和穿孔素基因RT－PCR产物电泳条带与对照组比较，条带变细，色淡；而环磷酰胺加“三花散”实验组条带明显增宽、色亮，显示该组Fas配体和穿孔素基因表达增强。而各组内参比的β－actin基因产物条带均一，具有可比性。

4　讨论

蒙药作为民族医药的一部分，其用药特点是以生药入药，保持了原药材的高生物活性物质，尤其对于治疗各种功能性疾病、慢性病、疑难杂症以及调节、恢复人体正常的免疫功能等有独到的疗效。此外，蒙药在组方时重视药物间的相生相克、相辅相成，所以它具有高效低毒、发挥复合药理作用、疗效可靠等优点。我国现有蒙药2230种，常用约450种，其来源包括植物、动物和矿物。许多实验研究显示，蒙药可提高机体免疫功能，可促进免疫器官的发育，并通过激活单核吞噬细胞和天然杀伤细胞，促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖、分化和免疫球蛋白的产生，增强机体的抗病力。本实验参照常用CY制备小鼠免疫抑制模型法，制作动物模型，利用现代技术，研究蒙药“三花散”醇提液的作用机制，结果表明，蒙药“三花散”醇提液能提高小鼠的非特异性免疫和细胞免疫水平等。

众所周知，单核吞噬细胞系统细胞具有很强的吞噬能力，是参与机体非特异性免疫的重要部分。它能直接吞噬异物、损伤的细胞、蜕变的细胞、肿瘤细胞及大分子物质。由于这类细胞表面都含有对于免疫球蛋白和补体的受体，其可以发生调理吞噬和免疫黏附反应。而且巨噬细胞具有多种胞内酶与胞外酶，能够有效地消化、杀灭所吞噬的病原体和异物。本实验中鸡红细胞作为一种异物注入小鼠腹腔内，可引起巨噬细胞聚集将其吞噬并逐步消化，温育后观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的情况，可反应机体非特异性免疫功能状态。细胞免疫是T细胞介导的一种重要免疫反应，T细胞可以产生各种淋巴因子，致敏的T淋巴细胞与相应的抗原再次接触后，可直接破坏抗原或带有抗原的靶细胞。T淋巴细胞转化率试验是测定机体细胞免疫功能的重要指标。本实验结果显示不同剂量的蒙药“三花散”醇提液均能使小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬百分率、吞噬指数和淋巴细胞转化率明显升高，阴性对照(生理盐水)组与阳性对照(环磷酰胺)组之间均有极显著性差异(P＜0.01)，实验组与阳性对照(环磷酰胺)组之间均有极显著性差异(P＜0.01)，并且高剂量药物作用明显高于低剂量(P＜0.05)，说明蒙药“三花散”的醇提液能改变小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能及淋巴细胞转化率，使其作用明显增强。而且说明“三花散”提高机体免疫功能的作用在该组实验范围内与给药剂量呈正相关。

Fasl是一种C末端位于细胞外的Ⅱ型跨膜蛋白，为细胞表面分子，属于肿瘤坏死因子家族成员，导致表达Fas的细胞死亡，主要表达于活性T细胞、NK细胞及LAK细胞等免疫细胞；穿孔素又称成孔蛋白(pore－forming protein，PFP)，是主要存在于自然杀伤细胞(NK)细胞和细胞毒性T细胞(CTL)胞浆细胞毒颗粒中的一种糖蛋白。目前研究证实，淋巴细胞介导的细胞毒作用主要有两条途径：(1)颗粒出胞途径，即穿孔素途径。CTL细胞受到刺激后，释放穿孔素、颗粒酶，穿孔素与靶细胞膜上的受体结合，形成膜表面的活性孔道，从而改变靶细胞的渗透压，同时细胞毒颗粒内的颗粒酶A、B通过此孔道进入靶细胞，诱导细胞凋亡。(2)跨膜信号传导途径，即Fas/Fasl途径。通过淋巴细胞表面的Fasl与靶细胞表面的Fas结合而诱导靶细胞的凋亡。因此淋巴细胞表面的Faal、穿孔素的表达水平，可以显示其免疫活性和免疫状态。脾脏是最大的淋巴器官，其细胞组成中含有大量的淋巴细胞。本实验采用RT－PCR的方法，测定实验小鼠脾脏组织Fasl及穿孔素mR－NA相对表达量。结果显示，实验组Fasl、穿孔素在mRNA水平的表达较高，而环磷酰胺组Fasl、穿孔素的表达量较低。说明蒙药“三花散”醇提液可以调节免疫细胞的活性，从而提高机体免疫力。

总之，蒙药“三花散”醇提液的免疫增强作用可能与蒙药的整体调节、双向调节有关，从而增强机体的抗病能力，使机体内外环境达到平衡，正如《黄帝内经》所说，“正气存内，邪不可干”，这可能也是蒙药“三花散”用于抗炎、抗病毒、抗肿瘤的作用机制。通过不断深入的研究，其作用机理以及药理功能将得到更进一步阐明。