高效液相色谱法测定丙酯注射液含量及有关物质
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[摘要] 目的：建立丙酯注射液含量与有关物质测定的高效液相色谱分析方法。方法：采用Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-水（55∶45）（用磷酸调pH值为3.0），检测波长为274 nm，流速为1.0 ml/min，柱温为25℃，进样量为10 μl。结果：没食子酸与丙酯主峰达到基线分离，分离度符合要求。没食子酸最低检出量为0.8 ng，丙酯最低检出量为0.9 ng。3批样品中有关物质的平均含量为0.11%。样品浓度在19.02～57.06 μg/ml的范围内与峰面积呈良好的线性关系（r=1.000），平均回收率为99.8%，RSD为0.39%。结论：本检测方法专属性强、结果可靠、重复性良好，可用于丙酯注射液的质量控制。
[关键词] 丙酯注射液；有关物质；含量测定；高效液相色谱法
[中图分类号]R927 [文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2009）06（c）-063-03
Content determination of Propylgallate Injection and its related substances by HPLC
XU Xingmin1, LI Jianhe2, WU Xiaoqun1, PENG Liubao2, CAO Junhua2, LUO Xia2
(1.Department of Pharmacy, People's Hospital of Xiangxi Autonomous Perfecture, Jishou 416000, China；2. Department of Pharmacy, the Second Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410011, China)
[Abstract] Objective: To establish a high performance liquid chromatograph(HPLC) method for the determination of Propylgallate Injection and its related substances. Methods: The chromatographic separation was performed on a Diamonsil C18 column(250 mm×4.6 mm, 5 μm) with mobile phases of methyl alcohol-water(55∶45) (pH adjusted to 3.0 with phosphoric acid). The detection wavelength was 274 nm, the flow rate was 1.0 ml/min, the column temperature was 25℃ and the sample size was 10 μl. Results: Gallic acid and propylgallate were well separated by this method, and the separation degree was accorded with the demands. The detection limit of gallic acid and propylgallate was 0.8 ng and 0.9 ng, respectively. The average content of the related substances in three batches of samples was 0.11%, the linear range of propylgallate was 19.02-57.06 μg/ml(r=1.000) and the average recovery was 99.8% with a RSD of 0.39%. Conclusion: The method is sensitive, accurate, rapid and can be used in the quality control of Propylgallate Injection.
[Key words] Propylgallate Injection; Related substance; Content Determination; HPLC
丙酯（propylgallate）是在对活血化瘀中药赤芍深入研究的基础上，对其主要有效成分没食子酸酯进行结构修饰而得到的具有更强生物效应的化合物。临床用于预防和治疗脑血管疾患、冠心病、心绞痛、外科手术后的并发症血栓性深静脉炎等，具有良好的疗效[1-6]。笔者在研究开发丙酯注射液时，为有效控制其质量，建立了高效液相色谱法测定该制剂中主药含量及有关物质的方法。结果表明，本方法简便、准确、专属性好、灵敏度高。
1 仪器与试药
1.1 仪器
LC-10ATvp高效液相色谱仪（日本岛津）；SPD-10A紫外检测器（日本岛津）。
1.2 试药
丙酯注射液（规格为5 ml∶180 mg，批号为20080203、20080204、20080205，均由中南大学湘雅二医院药剂科研制提供）；丙酯对照品（批号为100203-200803，含量为99.8%，由中国药品生物制品检定所提供）；甲醇色谱纯；其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
本品主药为酯类物质，制剂或贮存过程中可水解成相应的酸和醇，为控制本品制剂工艺和贮存过程中的质量，对本品有关物质采用高效液相色谱法进行研究。
2.1.1 溶液的制备
2.1.1.1 空白辅料溶液的制备按处方配制成1 000 ml的空白辅料溶液，备用。
2.1.1.2 供试品溶液的制备取本品溶液1 ml（约相当于丙酯36 mg），置100 ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
2.1.1.3 对照溶液的制备精密量取供试品溶液1 ml，置100 ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
2.1.2 色谱条件色谱柱为Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：参照注射用丙酯国家药品标准[7]，选用甲醇-水（55∶45）（用磷酸调pH值为3.0）为流动相；流速为1 ml/min；检测波长：取没食子酸、丙酯各适量，分别用流动相制成10 μg/ml的溶液，照分光光度法（《中国药典》2005版二部附录ⅣA），在400～200 nm波长范围内测定，结果没食子酸与丙酯分别在273.5 nm和274.0 nm波长处有最大吸收波长，兼顾丙酯和有关物质的响应值，选择274 nm波长作为本品有关物质的测定波长。进样量为10 μl。
2.1.3 系统适应性试验按上述色谱条件，精密量取对照溶液10 μl，注入液相色谱仪中，记录色谱图，调节检测器灵敏度，使主成分峰峰高为满量程的10%～25%，再精密量取上述供试品溶液及对照溶液各10 μl，分别注入液相色谱仪测定。记录供试品溶液色谱图至主成分峰保留时间的2倍。
2.1.4 空白溶剂与空白辅料溶液试验精密量取空白溶剂10 μl，注入液相色谱仪检测，记录色谱图。精密量取空白辅料溶液1 ml，置100 ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液10 μl，注入液相色谱仪检测，记录色谱图，见图1。测定结果表明，辅料的色谱图与空白溶剂的色谱图基本相同，辅料溶液不干扰样品测定。
图 1 空白辅料干扰图谱
Fig.1 The chromatogram of interfering test for blank supplements
2.1.5 丙酯与没食子酸最小检出量测定精密量取丙酯注射液1 ml置100 ml容量瓶中，加流动相逐级稀释测定，当S/N≈3，样品浓度为0.09 μg/ml，进样量为10 μl，最低检出量为0.9 ng。精密称取没食子酸适量，加流动相逐级稀释测定，当S/N≈3，样品浓度为0.08 μg/ml，进样量为10 μl，最低检出量为0.8 ng。
2.1.6 没食子酸与丙酯的分离度试验取丙酯适量，加流动相适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，取上述溶液10 μl，注入液相色谱仪检测，记录色谱图，结果丙酯的保留时间约为7.75 min。取没食子酸适量，加流动相适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，取上述溶液10 μl，注入液相色谱仪检测，记录色谱图。另取上述没食子酸、丙酯溶液混合均匀，量取10 μl注入液相色谱仪，记录色谱图，结果二者的分离度（R）为13.9，表明没食子酸与丙酯主峰达到基线分离，分离度符合要求。
2.1.7 破坏性试验
2.1.7.1 酸破坏量取本品约0.5 ml置50 ml烧瓶中，加1 mol/L盐酸溶液20 ml，在电子控温电热套上回流30 min后，取出放冷，用碱溶液调至中性，加流动相定容至50 ml，滤过，取滤液10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
2.1.7.2 碱破坏量取本品约0.5 ml置50 ml烧瓶中，加1 mol/L氢氧化钠溶液20 ml，在电子控温电热套上回流30 min后，取出放冷，用酸溶液调至中性，加流动相定容至50 ml，滤过，取滤液10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
2.1.7.3 氧化破坏量取本品约0.5 ml，置三角瓶内，加10%过氧化氢溶液20 ml，在电炉上小火煮沸5 min，取出，放冷，加流动相定容至50 ml，过滤，取滤液10 μl注入液相色谱仪，记录色谱图。
上述结果表明，本品在酸、碱、10%过氧化氢溶液中都有不同程度的破坏降解，但降解产物能与样品主峰基本分离，在该色谱条件下能有效地测定本品有关物质。
2.1.8 样品有关物质测定取本品1 ml置100 ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1 ml置100 ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。量取对照溶液10 μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分峰高为满量程的10%～25%，量取上述两种溶液各10 μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍，供试品溶液的色谱图中如显杂质峰，量取各杂质峰面积之和与对照溶液主峰面积比较（1.0%），测定结果见表1。结果表明，3批样品的有关物质均小于1.0%。自身对照法与面积归一法计算有关物质，其结果基本一致。
表 1 3批样品有关物质测定结果（%）
Tab.1 The results of the related substance determination in three batches of samples（%）
2.2 含量测定
本品主要的有关物质没食子酸与主药的紫外吸收特征基本一致（其水溶液在272 nm的波长处均有较大吸收），利用紫外分光光度法对本品进行含量测定时，不能排除没食子酸对测定结果的干扰。为提高含量测定方法的科学性，本文采用高效液相色谱法对主药丙酯与杂质（没食子酸）在色谱柱中分离后进行测定。
2.2.1 色谱条件与系统适用性试验同有关物质测定项下。
2.2.2 线性关系试验精密称取丙酯对照品约95 mg，置100 ml容量瓶中，加流动相超声溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密量取上述溶液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml置100 ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，分别量取上述溶液10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以平均峰面积（A）为纵坐标，浓度（C）为横坐标，进行线性回归，得回归方程为A=1 157.60＋60 654.75C，相关系数r=1.000。结果表明，样品浓度在19.02～57.06 μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.2.3 稳定性试验取上述38.04 μg/ml的对照品溶液室温放置8 h，分别在0、1、2、4、6、8 h进样10 μl，其平均峰面积为2 197 616.05，RSD为0.08%，表明稳定性良好。
2.2.4 精密度试验取上述38.04 μg/ml的对照品溶液，分别连续进样6次，测定其峰面积，其平均峰面积为2 201 738.5，RSD为0.06%，表明此方法进样精密度良好。
2.2.5 回收率试验精密称取经105℃干燥至恒重的丙酯对照品适量（高43.2 mg，中36.0 mg，低28.8 mg各3份），共9份，置100 ml容量瓶中，模拟丙酯注射液的处方及工艺配制成样品，加流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取1 ml置100 ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另取经105℃干燥至恒重的丙酯对照品约36 mg，精密称定，加流动相制成每毫升中含36 μg的溶液，作为对照品溶液，取供试品溶液与对照品溶液各10 μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，回收率测定结果见表2。 结果表明，用HPLC法测定丙酯注射液含量，平均回收率为99.8%，RSD为0.39%，回收率试验良好。
表 2 含量测定回收率试验结果
Tab.2 The results of recovery test for the determination of content
2.2.6 含量测定精密量取本品1 ml置100 ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1 ml置10 ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另取经105℃干燥至恒重的丙酯对照品适量，加流动相制成每毫升中含36 μg的溶液作为对照品溶液，取供试品溶液与对照品溶液各10 μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见图2。按外标法以峰面积计算，批号为20080203、20080204、20080205的3批样品的标示百分含量分别为100.1%、99.8%、100.5%。测定结果表明，3批样品含量均在95.0%～105.0%之间。
图 2 含量测定图谱
（A．对照品；B．供试品）
Fig.2 The chromatogram of the assay
(A.Reference substance; B.Test sample )
2.2.7 重复性试验取批号为20080203的样品，按照上述方法配制6份供试品溶液，按上述含量测定下的方法操作，结果测得其平均标示百分含量为100.3%，RSD为0.25%。表明HPLC法测定本品含量重复性良好。
3 讨论
由本品结构可知，本品主要降解产物为没食子酸和丙醇，其中没食子酸存在紫外吸收特征，因此根据没食子酸、丙酯在流动相溶液中的紫外吸收图谱特征，确定本品有关物质的检测波长。没食子酸的最大吸收波长为273.5 nm，丙酯的最大吸收波长为274 nm，没食子酸与丙酯在274 nm的波长处均有较大吸收，兼顾丙酯和有关物质的响应值，选择274 nm波长作为本品有关物质的测定波长。
丙酯原料药的含量测定采用重量法[8]，但丙酯注射液空白辅料干扰该含量测定方法，因此无法采用重量法测定其含量。参考文献[9-13]，丙酯在紫外区有最大吸收峰，试验证明空白辅料在此紫外区不干扰样品的测定，故可采用紫外分光光度法和高效液相色谱法测定其含量。本品主药为酯类物质，制剂或贮存过程中可水解成相应的酸和醇，主要的有关物质没食子酸与主药的紫外吸收特征基本一致，其水溶液在272 nm波长处均有较大吸收，利用紫外分光光度法对本品进行含量测定时，不能排除没食子酸对测定结果的干扰。为增加含量测定方法的科学性，控制本品制剂工艺和贮存过程中的质量,此处利用高效液相色谱法对主药丙酯与杂质（没食子酸）在色谱柱中分离后进行测定,方法简便易行、专属性强、结果准确可靠。
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（收稿日期：2009-03-25）