不同苹果砧木组培苗抗旱性的比较研究
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摘 要： 【目的】为了提供苹果耐旱育种及栽培材料，【方法】以5种苹果砧木组培苗为试材，PEG-6000作为胁迫剂，模拟室外干旱进行处理，运用模糊隶属函数抗旱性综合分析，比较了5个苹果砧木组培苗的耐旱性。【结果】结果表明，在PEG-6000胁迫条件下，不同苹果砧木的叶绿素含量总体均呈下降趋势，叶片的相对电导率和MDA含量随PEG-6000胁迫质量分数的升高逐渐升高。在整个胁迫过程中，各苹果砧木组培苗叶片内蛋白质含量随胁迫质量分数的升高而增大。SOD活性随PEG-6000胁迫质量分数的升高呈先升高后下降趋势，且在20%PEG-6000胁迫条件下SOD活性达到了最大。POD活性随胁迫质量分数的升高呈现出逐渐升高的趋势。【结论】5种苹果砧木的抗旱性顺序依次为：新疆野苹果>平邑甜茶>八棱海棠>‘M26’>‘M9’。
关键词： 苹果砧木组培苗； PEG-6000胁迫； 抗旱性评价
中图分类号：S661.1 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪01-0088-06
苹果是世界上栽培的主要果树，也是我国果树栽培中面积最大的树种。干旱是影响苗木成活与生长的重要限制因子[1]，也是一种影响植物生产最普遍的环境胁迫[2]，更是导致减产最严重的环境胁迫[3]。全球范围内因干旱导致的作物产量损失超过其他环境胁迫造成减产总和[4]，2005年巴西干旱缺水，导致巴西全国苹果产量直接减少35%[5]。因此选育抗旱性强的苹果砧木，用于维持苹果产量与品质、扩大栽培面积一直是干旱地区果树栽培的主要任务[6]。苹果树常规育种周期长，占地面积大，限制了耐旱性品种的选育与筛选。前人对苹果种质资源的抗旱性研究已为抗旱苹果品种的选育提供了很多理论依据[7]，但苹果砧木的抗旱性鉴定仍存在不少问题，例如：（1）对苹果矮化砧木和乔化砧木的抗旱性没有比较研究；（2）对品种的抗旱性鉴定花费时间长。而植物组织培养可以通过转基因手段或筛选基因突变体来缩短培育周期，有利于果树树种的选育。迄今国内外有关苹果组培苗抗旱性研究的相关报道较少，仅赵军营[8]对‘嘎拉’苹果进行过相关研究。本研究首先在材料选择上选取了矮化砧木‘M9’、‘M26’和乔化砧木八棱海棠、平邑甜茶、新疆野苹果进行对比，同时利用这些材料的组培苗作为试材，通过研究其对PEG-6000胁迫的反应，从而建立高效的苹果幼苗抗旱性早期鉴定技术体系，为苹果抗旱无性系筛选及资源鉴定提供依据。
1 材料和方法
1.1 材料
试验于2009年3月于西北农林科技大学苹果示范基地进行，以‘M9’、‘M26’、八棱海棠（M. micromalus Mak.）、平邑甜茶（M. hupehensis Rehd.）和新疆野苹果[M. sieversii （Ledeb） Roem.]5个苹果属树种的1 a生枝条为试材。将上述材料置于27 ℃温室内水培，每升水中加入1/8MS和5 g蔗糖，诱导芽的萌发，每5 d换水1次[9-10]。待芽长至1.5～2.0 cm 时，剪取嫩芽去掉大叶，在自来水下冲洗3～4 h，用体积分数为75%的酒精消毒10 s，结合质量分数为0.1%升汞消毒8 min后，用含50 mg・L-1抗坏血酸的无菌溶液冲洗3～4次茎尖后[11]，接种到MS+6-BA1.0 mg・L-1 +NAA0.1 mg・L-1附加500 mg聚乙烯吡咯烷酮的培养基中培养，待新芽长出后，切取新芽接入继代培养基（MS培养基加6-BA0.5～1.0 mg・L-1，IBA0～0.5 mg・L-1）中增殖。每瓶内接3～4个芽，光照12～14 h・d-1、光照强度2 000 lx，25 ℃条件下培养。
1.2 方法
不同材料的胁迫培养基为继代培养基附加不同质量分数的PEG-6000，分别为 0 （CK）、10% （B1）、15% （B2）、20% （B3）、25%（B4），共5水平，重复3次。在无菌条件下将培养到第4 代的不同苹果砧木组培苗修剪成1.0 cm左右带顶芽的茎段，接种于设计的培养基上，每个品种每一处理各接种20瓶，置于培养室内培养。培养条件：光照时间为12 h /d，光照强度为2000 lx，培养温度为 23～27 ℃， 相对湿度为50%～70%。培养30 d后进行不同指标的测定。
1.3 测定指标与方法
叶绿素含量和电导率的测定参照刘世鹏[12]的方法。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、丙二醛（MDA）和可溶性蛋白（Pr）含量均参照孙群等[13]的方法测定。
1.4 苹果砧木抗旱性评定
植物抗旱性强弱受多种因子影响，通常用单一指标无法正确的评定，因此本试验通过对实验结果进行隶属函数[14]分析，对5种苹果砧木的抗旱性进行综合评价，从而比较各品种的抗旱性强弱。其计算公式如下：
1.5 统计分析
应用SA8.1统计软件进行Duncan’s新复极差显著性分析。
2 结果与分析
2.1 PEG-6000胁迫对苗叶绿素含量的影响
叶绿素是反映光合作用强度的重要指标，在干旱胁迫条件下，抗旱性越强，叶绿素含量下降的幅度越小。由表1可知，随着PEG-6000胁迫程度的加重，各砧木叶片的叶绿素含量总体上均呈现下降趋势，且叶绿素降低程度因品种差异而表现不同。在25% PEG处理下‘M9’、‘M26’、八棱海棠、平邑甜茶、新疆野苹果的相对叶绿素含量与对照相比分别下降了45.64%、52.01%、34.58%、12.07%、7.20%。由此可知，平邑甜茶和新疆野苹果的叶绿素含量下降幅度小。且除平邑甜茶在P< 0.05水平上，对照与B1及B2差异不显著外，其他品种各质量分数间均表现差异显著。
2.2 PEG-6000胁迫对叶片可溶性蛋白的影响
蛋白质是植物体内重要的渗透调节物质之一，含量的多少直接反映植物的生长状况，含量越多抗旱性越强。由表2可知，5个供试苹果砧木的对照与不同质量分数PEG-6000胁迫处理下可溶性蛋白含量差异显著。在整个胁迫过程中，各苹果砧木叶片内蛋白质含量随胁迫质量分数的升高而增大，在B4条件下，‘M9’、‘M26’、八棱海棠、平邑甜茶和新疆野苹果叶片中可溶性蛋白质含量也达到了最大，与对照处理相比可溶性蛋白质含量分别增加了38.75%、63.45%、49.94%、102.78%、122.93%。
2.3 PEG-6000胁迫对叶片质膜相对透性的影响
电导率的大小直接反应植物的抗逆性，值越大，抗性越弱。从表3可以看出，不同苹果砧木叶片的相对电导率随PEG-6000胁迫质量分数的升高而逐渐升高，且叶片质膜的相对透性增加幅度各不相同。各苹果砧木的相对电导率，在各质量分数处理与对照处理相比差异均显著。在B4质量分数胁迫处理下，‘M9’、‘M26’、八棱海棠、平邑甜茶和新疆野苹果的相对电导率与对照处理相比增加幅度依次为14.431%、11.891%、10.332%、7.790%、7.865%。由此可知新疆野苹果和平邑甜茶的抗旱性较‘M9’、‘M26’、八棱海棠的强。
2.4 PEG-6000胁迫对叶片SOD、POD活性的影响
超氧化物岐化酶（SOD）是植物保护系统中的主要保护酶，在此系统中处于核心地位，它的活力与植物的抗性关系密切。过氧化物酶（POD）能清除体内过多H2O2等过氧化物，是细胞内防御酶系统中体内自由基的清除剂。随着干旱胁迫的加剧，不同植物体表现出得活性不同。由表4可以看出，SOD活性随PEG-6000胁迫质量分数的升高表现为先升高后下降，各处理间差异均显著。在B3条件下‘M9’、‘M26’、八棱海棠、平邑甜茶和新疆野苹果的SOD活性均最高，分别是对照的1.22、1.15、1.23、1.24和1.78倍。
从表5可看出，不同苹果砧木POD活性变化随处理质量分数的增大呈逐渐升高的趋势。在胁迫处理后的30 d，与对照相比，B4处理POD活性分别提高了： ‘M9’ 1.376倍，‘M26’ 1.347倍，八棱海棠1.572倍，平邑甜茶1.425倍，新疆野苹果1.393倍。方差分析表明，5个供试苹果砧木的POD活性对照与不同质量分数PEG-6000胁迫处理差异显著。在P< 0.05水平上，除新疆野苹果CK与B1不显著外，其他品种的砧木均表现为差异显著。
2.5 PEG-6000胁迫对叶片丙二醛（MDA）含量的影响
丙二醛是膜脂过氧化的主要产物之一，其含量多少可以直接反映植物受害程度。干旱胁迫越严重，MDA含量越大，植物的抗旱性越弱。从表6可知，PEG-6000胁迫过程中，5种苹果砧木的丙二醛含量随着胁迫质量分数的升高均有所增加， 5个供试苹果砧木的MDA含量在对照与处理间差异均显著，在B4处理下，与其对照相比，各砧木丙二醛含量增加量依次为‘M9’ 4.357 mmol・g-1、‘M26’ 3.688 mmol・g-1、八棱海棠3.417 mmol・g-1、平邑甜茶2.582 mmol・g-1、新疆野苹果3.389 mmol・g-1。
2.6 苹果砧木组培苗抗旱性综合评价
本研究以不同胁迫质量分数下各指标平均值的隶属函数加权平均值作为品种抗旱性的综合评定标准，这样消除了个别指标带来的片面性，使各品种抗旱性差异具有可比性。平均隶属值越大抗旱性越强。由表7可以知，新疆野苹果的隶属值最大，表明其抗旱性最强，而‘M9’的隶属值最小，则抗旱性最弱。由此得出这几种苹果砧木的抗旱性依次为：新疆野苹果>平邑甜茶>八棱海棠>‘M26’>‘M9’。
为了进一步研究6个苹果砧木抗旱性指标间的协同变异程度， 对上述材料的SOD、POD活性，可溶性蛋白（Pr）含量，丙二醛（MDA）含量，叶片相对电导率（REC），叶绿素（Chl）含量进行了相关性分析（表8） 。由此表可以看出，用平均隶属值评价苹果砧木抗旱性最为科学。他与其他6个指标间的相关系数均达到了显著水平。决定系数均在0.5以上，说明可以用平均隶属值来代表其他6个指标表示苹果砧木抗旱性的大小。而其他6个指标间的相关性则相对较差。相对电导率与叶绿素，POD之间呈极显著正相关。可溶性蛋白与叶绿素之间呈极显著正相关。电导率大小反映出苹果叶片在干旱胁迫下细胞膜相对透性的变化，而叶绿素的变化则代表苹果砧木叶片叶绿体受害程度的大小，二者之间极显著正相关，说明在干旱胁迫条件下，叶绿素含量越小，叶片细胞在干旱胁迫下的伤害就越大，苹果砧木的抗旱性越差。可溶性蛋白含量的多少反映苹果砧木叶片渗透调节的能力，含量越多调节能力越强，抗旱性也越强。并且认为可溶性蛋白、叶绿素和电导率可作为鉴定组培苗抗旱的特定指标。
3 讨 论
干旱胁迫下，叶绿体结构受损，导致叶绿素含量下降[16]，试验研究表明，5种苹果砧木叶绿素含量的变化随胁迫浓度的质量分数的升高基本上呈下降趋势，新疆野苹果表现为先下降后升高然后再下降，但总体上呈现下降趋势。蛋白质因参与植物体内各种代谢，对渗透调节有一定的贡献作用[17]，它含量的多少直接反映植物的生长状况。本研究表明，随着胁迫质量分数的增大，各苹果砧木叶片内可溶性蛋白含量也达到了最大，说明可溶性蛋白对干旱胁迫的反应是敏感的。
质膜是植物抵御外界环境胁迫的第一道屏障，在环境胁迫下，植物细胞膜会受到不同程度的伤害。叶片相对电导率是反映叶片细胞膜受伤害的重要指标。细胞电解质外渗是细胞膜脂过氧化的必然结果。抗性越低，叶片质膜的相对电导率增幅越大[18]。新疆野苹果的增幅最小为7.865%，‘M9’的增幅最大为14.431%。
植物的光合作用和呼吸作用因干旱胁迫受到抑制，体内产生大量的活性氧自由基，导致细胞膜脂过氧化[19]和破坏膜结构[20]，但由于体内抗氧化酶系统的存在，因品种不同而表现的活性不同。本研究发现在PEG-6000胁迫质量分数逐渐加大的情况下SOD活性呈现先上升后下降的趋势，在20%PEG-6000质量分数处理下达到了最大，POD活性表现为始终上升。这与李霞等[21]在对黄檗保护酶活性的研究一致。SOD在胁迫质量分数最大时出现下降的情况，可能是由于细胞膜受到伤害，抗氧化酶活性被抑制的结果。这也表现出SOD比POD更容易受PEG-6000胁迫诱导。
在逆境胁迫下植物活性氧代谢失调，导致活性氧累积和膜脂过氧化损伤，造成丙二醛累积，胁迫越严重，MDA含量越大，则膜脂过氧化损伤越严重，抗旱性也越差[22]。
苹果的抗旱机制是一个复杂的生理生化变化过程，受多种因素影响，单一依靠一种或少数几个生理指标作为抗旱性强弱鉴定的依据是不太可靠的，并且很难反映其抗旱本质。本实验通过检测叶片相对电导率和MDA含量得出的结论就有差别。因此本文采用隶属函数法对供试材料进行了抗旱性鉴定，这样既消除了个别指标的片面性又使得各品种或种抗旱性差异具有可比性，最终将这几种苹果砧木的抗旱性划分为4类：高抗：新疆野苹果；中抗：平邑甜茶和八棱海棠；低抗：‘M26’；不抗：‘M9’。新疆野苹果与平邑甜茶的研究结果与谭冬梅[23]研究结果一致，‘M26’的抗旱性与闫芬芬[24]研究结果相似。并将平均隶属函数值与6项生理指标进行了相关性分析，结果表明隶属函数值与6项指标间均达到了显著相关，决定系数均达到了0.5以上，因此可以用平均隶属值来代替6项生理指标所代表的抗旱性。
4 结 论
采用鉴定组培苗可溶性蛋白、叶绿素和电导率这三种特定生理指标可预测后期苗子的抗旱性。最终得出这5种苹果砧木的抗旱性为新疆野苹果>平邑甜茶>八棱海棠>‘M26’>‘M9’。从研究材料和实验结果看，乔化砧木的抗旱性要高于矮化砧木的抗旱性。
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