龙胆泻肝汤不同提取部位对白念珠菌生物膜的抑制作用研究
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[摘要] 目的：观察龙胆泻肝汤提取物体外对白念珠菌生物膜形成影响，探讨其可能的作用机制。方法：采用XTT法和微量稀释法筛选龙胆泻肝汤各提取部位的抗菌活性并检测各提取物对白念珠菌生物膜的抑制作用。采用实时荧光定量PCR法检测其黏附相关基因ALS1和菌丝形成基因SUN41的表达量。结果：龙胆泻肝汤用石油醚、水、正丁醇、甲醇及乙酸乙酯提取部位对白念珠菌浮游菌的MIC分别为>1 000，>1 000，>1 000，125，125 mg·L-1；对白念珠菌生物膜的SMIC50分别为>1 000，>1 000，>1 000，500，500 mg·L-1；SMIC80分别为>1 000，>1 000，>1 000，>1 000，1 000 mg·L-1；1 000 mg·L-1的乙酸乙酯提取物能明显抑制黏附相关基因ALS1和菌丝形成基因SUN41的表达。结论：龙胆泻肝汤抗白念珠菌生物膜的活性部位为乙酸乙酯提取部位。
[关键词] 龙胆泻肝汤；白念珠菌；生物膜
龙胆泻肝汤出自《医方集解》，其由龙胆草、黄芩、栀子、泽泻、木通、当归、生地黄、柴胡、生甘草、车前子等10味中药组成，具有泻肝胆实火，清下焦湿热的功效，主治以头痛目赤、耳聋耳肿等为表现的肝胆实火上炎证及以阴肿、阴痒等为表现的肝经湿热下注证。目前临床上主要治疗淋病、非淋菌性尿道炎、霉菌性尿道炎等泌尿生殖系统感染以及其他非感染性疾病[1]。近期本课题组预试验也发现，龙胆泻肝汤对白念珠菌生物膜形成有抑制作用。
近年来，由于免疫抑制剂、广谱抗生素等广泛使用，免疫抑制患者真菌感染尤其是深部真菌感染的发病率逐年上升[2]。白念珠菌作为条件性致病性真菌所引起的机会性感染病例日益增多。在院内获得性感染中，由念珠菌所引起的占第4位，其致死率达40%，其中尤以白念珠菌感染率最高，在机体免疫功能低下者，白念珠菌可导致严重甚至是致死性的系统性感染[3]。然而，随着抗真菌药物的大量使用，真菌耐药现象越来越普遍，且抗真菌药物的毒副作用也不容忽视。研究表明，某些中药（包括复方、单味药、有效成分）也具有显著的抗真菌功效，且毒副作用较小[4]。本实验拟对中药复方龙胆泻肝汤对白念珠菌生物膜形成的影响进行初步研究。
1材料
1.1菌株与药物 白念珠菌（Candida albicans）SC5314由第二军医大学药学院姜远英教授惠赠。龙胆泻肝汤复方中10味中药，购于安徽中医药大学第一附属医院中药房。
1.2培养基 制备 RPMI 1640 液体培养基，用1 mol·L-1NaOH溶液调整该液体培养基在25 ℃的pH为（7.0 ±0.1），滤过灭菌，4 ℃保存备用。YPG培养基、沙氏培养基依据文献配制[5]。
1.3试剂 灭菌双蒸水（实验室自制），RPMI 1640粉末（美国Gibco公司），石油醚、甲醇、乙酸乙酯、正丁醇均为分析纯，由上海中试化工总公司提供。XTT（加拿大BBI公司），维生素K3（美国Alexis公司），均为分析纯。Total RNA提取试剂（日本ToyoBo公司），PCR反应试剂（日本ToyoBo公司），引物（上海生工生物工程有限公司）。
1.4仪器 318-酶标仪（上海三科仪器有限公司）；96孔微量培养板（美国Corning公司）；CKX41-32型倒置显微镜（日本Olympus公司）；RE2000B旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；ABI7000荧光定量PCR仪（美国生物应用系统公司）。
2方法
2.1制备 热回流法制备龙胆泻肝汤提取物：所购中药复方粉碎后置于1 000 mL圆底磨口烧瓶中，加70%甲醇溶液600 mL，于60 ℃水浴回流2 h，趁热过滤，所得滤渣重复上述操作2次，合并3次滤液。
提取物各萃取部位的制备[6]：将所得滤液取出一部分作为总提取物，即甲醇提取部位，另一部分滤液分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，通过点硅胶板判断萃取终点，分别得到各萃取液相，分别将甲醇相和各萃取液相于50 ℃水浴中减压浓缩至干重。
菌悬液的配制[7]：从4 ℃保存的沙氏培养基上挑取少量白念珠菌，接种至4 mL RPMI 1640培养液，于37 ℃，200 r·min-1振荡培养，活化16 h使白念珠菌处于指数生长期。取该菌液同样方法再次活化，16 h后用血细胞计数板计数，以RPMI 1640培养液调整菌液浓度至2×106CFU/mL备用。
2.2测定 各提取液对白念珠菌的最低抑菌浓度（MIC）测定：调整菌液浓度为2×103 CFU/mL，依据NCCLS的M27-A方案，采用微量稀释法，用无菌的RPMI 1640将5种提取物分别按2倍连续稀释成10个浓度梯度：2 000，1 000，500，250，125，62.5，31.25，15.6，7.8，3.9 mg·L-1。在96孔板中第1列加入2×103 CFU/mL的菌液100 μL和RPMI 1640培养基100 μL，第2列加入RPMI 1640液体培养基200 μL作空白对照。其余所有孔均加入100 μL的2×103 CFU/mL菌悬液，从3～12列依次加入上述配好的不同浓度的石油醚提取物的药液，每孔100 μL，使96孔板的每孔菌悬液终浓度为1×103 CFU/mL，37 ℃培养24 h，以无菌生长的最小药物稀释度作为菌株的最低抑菌浓度（MIC）。乙酸乙酯、正丁醇、甲醇和水提取物的药液同以上操作，每种提取物一次做3块板，重复3次。
抑制白念珠菌生物膜最低药物浓度（SMIC）的测定[8]：取浓度为2×106 CFU/mL的菌液，用RPMI 1640将5种提取物分别按2倍连续稀释成10个浓度梯度：2 000，1 000，500，250，125，62.5，31.25，15.6，7.8，3.9 mg·L-1。在96孔板中第1列加入2×106 CFU/mL的菌液100 μL和RPMI 1640液体培养基100 μL，第2列加入RPMI 1640液体培养基200 μL作空白对照。其余所有小孔均加入100 μL浓度为2×106 CFU/mL白念珠菌的菌液，从3～12列依次加入上述配好的不同浓度的石油醚提取物的药液，每孔100 μL，使96孔板的每孔菌液终浓度为1×106 CFU/mL，37 ℃培养24 h。
XTT减低法检测上述各提取物抑制生物膜50% （SMIC50）及80%（SMIC80）的药物浓度：XTT用0.5 g·L-1林格液稀释，并以0.22 μm孔径的滤器滤过除菌，分装后存放于4 ℃冰箱备用。临用前，加入维生素K3（用丙酮稀释至终浓度10 mmol·L-1）。取XTT-维生素K3溶液100 μL加到已形成生物膜的培养孔中（维生素K3在XTT中的终浓度为1 μmol·L-1），37 ℃避光培养2 h。用酶标仪（波长492 nm）检测各孔吸光度A。乙酸乙酯、正丁醇、甲醇和水提取物的药液同以上操作，实验重复3次。
2.3初步筛选出的提取部位（乙酸乙酯和甲醇）对白念珠菌生物膜作用的形态学观察 在96孔板第1列加入2×106的菌液100 μL和RPMI 1640培养液100 μL作为阳性对照，第2列加入RPMI 1640培养液200 μL作为空白对照，第3～11列先加入2×106 CFU/mL的菌液100 μL，于第3～5列再分别加入10 mg·L-1的乙酸乙酯提取物的药液100 μL，第6～8列分别加入100 mg·L-1的乙酸乙酯提取物的药液100 μL，第9～11列分别加入1 000 mg·L-1的乙酸乙酯提取物的药液100 μL。37 ℃培养24 h，倒置显微镜下观察白念珠菌生物膜形态的变化。甲醇提取物同以上操作。
2.4乙酸乙酯提取物对白念珠菌黏附相关基因和菌丝形成基因表达的测定[9-10] 总RNA的提取：龙胆泻肝汤不同提取部位中以乙酸乙酯提取物对白念珠菌的抑制作用最强，故本实验测定了乙酸乙酯提取物在1 000，100，10 mg·L-1时对白念珠菌黏附相关基因ALS1和菌丝形成相关基因SUN41表达的影响。在已形成的白念珠菌生物膜中分别加入药物浓度为1 000，100，10 mg·L-1的乙酸乙酯提取物500 μL，作用24 h后进行总RNA提取，并调节RNA浓度，使菌体模板量一致。具体操作方法参照ToyoBo公司MagExtractor-RNA-提取试剂说明书进行。
引物的设计与合成：根据NCBI基因库查得所需基因序列，并用Primer Premier 5.0软件设计所需引物，委托上海生工合成引物，各引物情况见表1。
反转录PCR：遵照ToyoBo公司ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover试剂盒说明的反应条件将提取的总RNA反转录成cDNA。
实时荧光定量PCR反应：采用SYBR Green Realtime PCR Master Mix试剂盒（ToyoBo公司），按操作说明书进行，取2×SYBR Green Real-time PCR反应混合液12.5 μL，ddH2O 10 μL，待扩增基因的上下游引物各1 μL，模板cDNA 0.5 μL加入0.2 mL荧光定量PCR管至终体积25 μL。扩增反应在ABI7000荧光定量PCR仪上进行，反应条件：预变性95 ℃ 60 s；变性95 ℃ 15 s；退火50 ℃ 15 s；延伸72 ℃ 45 s，从变性到延伸重复40个循环。每个样品均设置3重复，重复试验2次。
定量分析：实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分别测定每个样品目的基因ALS1，SUN41及内参ACTIN的Ct值，实验结果取其平均值。采用相对定量方式表示各样品目的基因ALS1，SUN41的表达量，计算ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因及2-ΔCt值，2-ΔCt表示目的基因相对于内参基因的表达倍数。
2.5统计学处理 所有数据应用SPSS 17.0统计软件分析处理，计量资料以±s表示，组间差异比较采用单因素方差分析，以P
3结果
3.1各提取部位对白念珠菌悬浮菌的MIC 经检测龙胆泻肝汤5个提取部位中石油醚、水、正丁醇部位对白念珠菌悬浮菌的MIC均大于1 000 mg·L-1，甲醇和乙酸乙酯部位对白念珠菌悬浮菌的MIC均为125 mg·L-1。
3.2各提取物对白念珠菌生物膜的SMIC 经检测龙胆泻肝汤5个提取部位对白念珠菌生物膜的SMIC，石油醚、水、正丁醇部位对白念珠菌生物膜的SMIC50和SMIC80均大于1 000 mg·L-1，甲醇和乙酸乙酯部位对白念珠菌生物膜的SMIC50均为500 mg·L-1，SMIC80为>1 000，1 000 mg·L-1。
3.3乙酸乙酯及甲醇提取部位对白念珠菌生物膜形态学的影响 倒置显微镜下，对照组（不含药物）的白念珠菌细胞与其出芽延伸所形成的菌丝密集交织，并可沿着菌丝形成团块状聚集，呈现多层膜状结构即生物膜（图1中A）。对于乙酸乙酯和甲醇2种提取物，在10 mg·L-1时，可见由较多酵母细胞与菌丝组成的较稀疏的生物膜；在100 mg·L-1提取物作用下，可见较少的酵母细胞与菌丝；当提取物剂量提高至1 000 mg·L-1时，只出现少数稀疏分散的酵母细胞，无明显菌丝出现（图1，2）。提示一定浓度的乙酸乙酯和甲醇提取物能通过影响白念珠菌的增殖及菌丝形成进而抑制其生物膜的形成，但2种提取物相比较而言，乙酸乙酯提取物对白念珠菌的抑制效果强于甲醇提取物（图1，2）。
3.4实时荧光定量PCR的结果 10 mg·L-1的提取物对ALS1和SUN41的表达无影响；100 mg·L-1的乙酸乙酯提取物可以一定程度的抑制ALS1和SUN41的表达，2个基因相对于空白组的表达倍数分别下调了1.23，1.07倍；1 000 mg·L-1的提取物可明显下调ALS1和SUN41的表达，分别下调了1.66，1.37倍（图3）。
4结论与讨论
白念珠菌是一种常见的条件致病菌，容易附着于生物组织材料的表面，形成一种由大量基质将其自身包裹的生物膜。生物膜形成后，膜内的菌细胞能够逃逸抗生素的杀伤作用和机体免疫系统的清除，并成为潜在的感染源，从而造成感染的反复发作。目前常用于临床的抗真菌药物种类有限，也难以杀死膜内菌，长期使用容易产生耐药性，且副作用较大。因此从中药中发掘具有抗真菌及其生物膜作用的药物成为重要的研究方向。
中医临床常用的抗白念珠菌复方较多，除龙胆泻肝汤外，还有肤疾安喷雾剂、知母合剂、复方苦槿霜等[11]对白念珠菌均有一定的抑制作用。由于龙胆泻肝汤在临床上应用广泛，故本课题组探讨其抗白念珠菌生物膜的作用，实验采用热回流法提取复方的有效成分，其优点是提取充分。筛选中药不同提取物可以为进一步分离鉴定出活性成分提供基础。试验在前期研究的基础上采用半定量检测白念珠菌生物膜代谢的最常用方法即XTT减低法进一步探讨龙胆泻肝汤不同提取部位体外抗白念珠菌生物膜的影响，该方法在不破坏生物膜的条件下能检测出生物膜中菌细胞的活性。通过对龙胆泻肝汤提取物的甲醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇及水部位进行活性研究实验，结果显示，龙胆泻肝汤的乙酸乙酯和甲醇提取物对白念珠菌悬浮菌和生物膜具有良好的抑制作用，且乙酸乙酯提取部位优于甲醇提取部位。
白念珠菌是具有酵母-菌丝二相性的真核微生物，菌丝的出现对其致病性与生物膜的形成均至关重要[7]。本实验从形态学上进一步验证龙胆泻肝汤的乙酸乙酯和甲醇提取物对白念珠菌生物膜的影响。提示一定浓度的该复方乙酸乙酯和甲醇提取物能影响白念珠菌的菌丝形成进而抑制其生物膜的形成。结合形态学观察和SMIC80检测，可以认为乙酸乙酯提取物对白念珠菌生物膜形成的抑制作用总体上强于甲醇提取物。
因此，试图从基因层面探讨乙酸乙酯提取物抑制白念珠菌生物膜的作用机制。白念珠菌生物膜形成主要取决于菌体早期的黏附和菌丝形成等环节。有研究表明，白念珠菌ALS基因家族有8个成员，它们所编码的甘油磷酸肌醇 （GPT）锚定蛋白在不同条件下的白念珠菌的黏附中起作用[12]，NOBILE等[13]认为ALS1在生物膜的形成中发挥了重要作用。SUN基因家族包含2个基因SUN41和SIM1，其中SUN41参与细胞壁和生物膜的形成以及菌丝对宿主细胞的黏附等活动[14]。
针对上述白念珠菌黏附相关基因ALS1和菌丝转化相关基因SUN41进行qRT-PCR实验。结果表明，随着乙酸乙酯提取物浓度的提高，上述2种基因表达倍数逐渐降低，说明mRNA的转录受到了抑制，尤其以1 000 mg·L-1的提取物明显下调ALS1和SUN41的表达。因此推测龙胆泻肝汤对白念珠菌黏附和菌丝的影响可能是其抑制或干扰了ALS1和SUN41的转录和表达，从而抑制白念珠菌黏附及之后菌丝形成。
鉴于龙胆泻肝汤复方由10味中药组成，有效成分较为复杂，其乙酸乙酯提取部位中抗白念珠菌生物膜的具体有效成分的种类及性质等有待研究，且白念珠菌生物膜的形成也是一个由多因素参与调控的复杂过程，因此该复方乙酸乙酯提取部位干预白念珠菌生物膜形成的详细机制还有待于进一步探讨，但至少本实验为龙胆泻肝汤临床治疗白念珠菌感染提供了一定的实验依据。
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Study on inhibitory effect of different extract fractions from Longdan
Xiegan decoction on biofilms of Candida albicans
YU Li-hua， LU Ke-qiao， SHI Gao-xiang， YAN Yuan-yuan， HE Liang， SHAO Jing，
WANG Tian-ming， WANG Chang-zhong*
（School of Integrated Chinese and Western Medicine， Anhui University of Traditional Chinese Medicine， Hefei 230038， China）
[Abstract] Objective： To observe the inhibitory effect of different extract fractions from Longdan Xiegan decoction on biofilms of Candida albicans， and discuss its possible mechanism. Method： The micro-dilution method and the XTT reduction assay were adopted to explore the antifungal activity of different extract fractions from Longdan Xiegan decoction and detect the inhibitory effect of different extracts on biofilms of C. albicans. The expression quantity of the adhesion related gene ALS1 and hypha formation SUN41 were detected by qRT-PCR. Result： The MICs of extracts from Longdan Xiegan decoction， including petroleum ether， water， butanol， methanol and ethyl acetate， against C. albicans were >1 000， >1 000， >1 000， 125， 125 mg·L-1. The SMIC50 against biofilms of C. albicans were >1 000， >1 000， >1 000， 500， 500 mg·L-1. The SMIC80 were >1 000， >1 000， >1 000， >1 000 and 1 000 mg·L-1. 1 000 mg·L-1 ethyl acetate extracts could considerably inhibit the expression of the adhesion related gene ALS1 and hypha formation SUN41. Conclusion： The ethyl acetate extract showed the greatest activity against Candida albicans biofilms.
[Key words] Longdan Xiegan decoction； Candida albicans； bio-film
doi：10.4268/cjcmm20140726