永州市鸡蛔虫线粒体cox2基因序列测定与分析

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摘要 该研究旨在阐明永州市鸡蛔虫各分离株线粒体细胞色素c氧化酶第II亚基（cox2）基因部分序列（pcox2）的遗传变异的情况。应用酶链聚合式反应（PCR）扩增鸡蛔虫的pcox2，采用clustalx1.81的程序对目的产物序列进行比对分析，结果表明：所获得的cox2（pcox2）序列完全相同，为450 bp（pcox2）。由于目的产物序列pcox2基因种内的序列相对保守，种间差异比较大，故能作为种间遗传与变异研究的标记，为鸡蛔虫分类和鉴定及流行病学调查奠定基础。

关键词 鸡蛔虫；线粒体DNA；cox2基因；种系发育关系

中图分类号 S852.73+9 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）08-0244-02

鸡蛔虫（Ascaridia galli）广泛寄生在禽类体内，在世界各地均有分布，严重影响禽类的健康。因此，鸡蛔虫病的预防、控制和科学诊断有着重要的生产和学术价值。进行鸡蛔虫病的预防和控制时，鸡蛔虫的物种分别和识别是非常重要的[1-5]。

线粒体基因组，作为一种重要的遗传学研究的标记[5-7]，具有母系遗传、进化速率快、结构简单、缺少重组等特点。通过测定线粒体的序列和基因组成，研究发现人类的疾病与线粒体DNA（mtDNA）的变异相关[8-10]。该研究以永州市鸡蛔虫为研究对象，利用线粒体DNA（mtDNA）中cox2基因作为分子标记对鸡蛔虫进行线粒体cox2基因序列的测定与分析。

1 材料与方法

1.1 虫体样品

该试验研究所用的6条鸡蛔虫样品采自永州零陵区（LL-1）、冷水滩区（LST-2）、东安县（DA-3）、双牌县（SP-4）、道县（DX-5）、宁远县（NY-6）。均置于70%酒精保存液里面保存。

1.2 试验试剂

DNA提取试剂盒WizardTM DNA Clean-Up System，为Promega产品；Ex Taq酶、DL-2000 DNA Marker。DNA胶回收试剂盒为TaKaRa产品。

1.3 试验方法

1.3.1 虫体DNA提取。取出单个虫体，用双蒸水、纯净水分别冲洗3、3～4次（先双蒸水后纯净水），装入Eppendorf管（规格1.5 mL）中，捣碎虫体组织，加入GT buffer（规格200 μL）中反复研磨，再加入蛋白酶K 20 μL混匀，置于60 ℃恒温水浴箱中消化30 min，注意每5 min混匀1次。完全消化后按试剂盒说明书提取DNA，提取的DNA样本存储在-20 ℃条件下。

1.3.2 PCR扩增。根据基因库已有的序列，设计特定的引物，序列如下：

COX2F：GTTCTGTAGT GTATTTCGTA CTTTGAT

COX2R：ATCACATAT AGTAATTCGA CACATCAA

引物由金思瑞生物科技有限公司进行合成。扩增体系为50 μL，其中双蒸水33 μL、10×PCR Buffer 5 μL、MgCl2 8 μL（25 mmol/L）、dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL、Primer（10 pmol/L）2 μL、Taq polymerase（5 U/μL）0.5 μL、模板DNA 1 μL[1]；反应在Biometra循环反应仪上进行，扩增条件：94 ℃预变性5 min，然后94 ℃变性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共37个循环，最后72 ℃延伸5 min。取PCR产物6 μL在1% TBE含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶中电泳[1-2]。通过紫外线观察并记录试验结果。

1.4 pcox2序列测定

将pcox2 PCR产物用DNA切胶回收试剂盒切胶回收纯化后送南京金思瑞公司测序。

2 结果与分析

2.1 PCR 扩增结果

pcox2约480 bp，6个样品均扩增出与设计长度基本相符的条带，均无杂带。取全部样品上样进行电泳，PCR产物电泳结果。

2.2 测序结果及分析

测序结果显示，扩增的鸡蛔虫pcox2片段大小分别为440～460 bp，比较6条鸡蛔虫pcox2序列，结果显示，6个个体间的pcox2序列的差异在0～2.0%到0～3.3%；其主要差异是碱基置换和颠换。6个分离株pcox2碱基仅仅差6 bp；永州各样品的分离株相互之间的pcox2序列差异在2%以内，经NCBI基因库比对，与其他蛔虫pcox2的差异度均高于12%。分析碱基组成，6个分离株pcox2的G+C含量最高为36.14%；A+T含量最低为63.86%。

2.3 cox2序列系统发生树

通过种系发育分析结果显示，利用Mega 4.1的NJ法构建得种系发育树，永州的各分离株同源性非常高，且均在同一分枝，发育发生树中的Bootstrap值较高，具体结果。

3 结论与讨论

从事寄生虫学研究的前提和基础是对寄生虫进行鉴定分类，对预防人畜共患的寄生虫病也具有重要意义。近年来，PCR技术发展快速，已在寄生虫学识别和分类上广泛应用。PCR技术一段特异性的基因片段的测序与分析，开创了寄生虫分类的新纪元。线粒体DNA（mtDNA）具有结构简单、分子量小、半自主性遗传、进化速率快、没有组织特异性等特点，是寄生虫鉴定分类和系统发育和进化的一种良好的分子标记技术[7]。研究认为半自主性细胞器线粒体基因是相对较理想的一种遗传标记细胞器[8-11]。线粒体基因更适用于种内遗传差异的研究[12-13]。

该试验应用PCR技术对来自永州鸡蛔虫分离株样品的线粒体DNA基因的部分序列（pcox2）进行了研究，比对发现各分离株之间相应序列的差异性均在2%以内，永州分离株与基因库中其他蛔虫差异度均高于12%。永州各分离株pcox2种内的变异远小于种间的变异，可以说明cox2是能够为蛔虫种间的遗传变异提供合适的遗传标记，可以用于鸡蛔虫的分类和鉴定。用不同的方法来绘制系统树均显示为一致性，永州市的6个分离株均出现在相同的一个发展关系。Bootstrap值较高，与D. latum关系相近。永州蛔虫离虫株分支较远，被很好地识别。该项研究的结果表明：鸡蛔虫pcox2在物种间的差异可以作为遗传标记，为鸡蛔虫的分子流行病学调查和分类以及群体遗传研究奠定了坚实的理论基础[14]。

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