高浓度胰岛素对人树突状细胞分化\成熟及免疫功能的影响
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中图分类号：R446 文献标识码 ：A 文章编号：1009_816X(2010)02_0100_03
Effects of Hyperinsulin on the Development and Maturation and Immune Function ofHuman Derived Dendritic Cells. CHEN Li_ping, YE Shuang_ying, WU Rong_zhen, et al. Lishui Center Hospital, Zheji ang 323000, China
［Abstract］ ObjectiveTo explore the effect of hyperinsulin on the maturation ofmonocyte_derived dendritic cells (DC).MethodsHuman monocytes were purifed usi ng successive adherence method, after 5 days' culture in RPMI1640 medium contain ing granulocyte_macrophage colony stimulating factor （GM_CSF，100ng/ml） and in terleukin_4（IL_4，100ng/ml）. Immature DC were then incubated with various conc entrations (0, 10, 100nmol/L) insulin for 48 hours. Immunophenotypic expressionof CD40, CD80 and CD83 was detected using flow cytometry. Mature DC secretions o f IL_12, IL_10 and TNF_α were measured by ELISA. The utralmicro structure of de ndritic cells was observed by microscope.ResultsHyperinsulin promoted CD40, CD 80 and CD83 expression and enhanced to excrete cytokine secretions of IL_12 andTNF_α significantly and decreased the excrete cytokines IL_10 secretion in heal thy human.ConclusionsHyperinsulin contributed to atherosclerosis via stimulati ng immune maturation of mature DC，which may be one of its mechanisms of AS.
［Key words］ Insulin; Dendriti cells; Immunity; Atherosclerosis
目前，越来越多的证据认为动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)从发生发展到转归就是一 个慢性炎症过程，其本质为免疫反应介导的慢性血管炎症病变［1，2］。免疫炎症反 应的发生和放大需要抗原递呈，而树突状细胞(Dendritic cells，DCs)是机体功能最强的专 职抗原递呈细胞。早年研究显示在动脉粥样硬化早期斑块中发现的树突状细胞明显低于晚期 斑块中发现的树突状细胞，脆性斑块中树突状细胞明显多于稳定斑块中树突状细胞［3 ］，这些发现表明树突状细胞与动脉粥样硬化发生发展有关。进而发现颈动脉脆性斑块中 有超过70％的树突状细胞表达活化标志物如CD83等［4］。胰岛素抵抗是动脉粥样硬 化风险相关的一个重要环节和过程，炎症反应是动脉粥样硬化和胰岛素抵抗的共同发病基础 。本实验旨在通过分离培养正常人DCs,使用高浓度胰岛素加以干预，通过测定DCs表型(CD40 、CD80、CD83)和检测分泌的细胞因子(1L_12、IL_10、TNF_α），探讨高浓度胰 岛素对DCs分化、成熟的影响。
1 材料与方法
1.1 实验材料：
1.1.1 对象：抽取健康志愿者的外周静脉血40ml。所有对象均排除急慢性炎性疾病， 未用激素及免疫抑制剂。
1.1.2 主要试剂：PBS和RPMI1640培养基购自美国GIBCO公司产品：特级无支原体无热 源胎牛血清购自美国BD公司产品；人淋巴细胞分离液购自天津市TBD生物技术有限公司产品 ；青霉素、链霉素购自华北制药有限公司产品：细胞因子rhGM_CSF、rhIL_4、TNF_α均为英国PEPRO Tech公司产品；CD83、CD40单抗、CD40二抗、CD80购自美国BD公司：IL_12、IL_10 、TNF_α购自上海森雄科技实业有限公司。
1.2 方法：
1.2.1 细胞培养：细胞培养方法详见文献报道［5］。第5日收集细胞，调整细胞 浓度1.0×106／ml,置于24孔板中，加入培养液1ml，分别加入胰岛素0ng/ml、10ng/ml和 100ng/ml继续置37℃、5%CO2孵箱培养48小时后，收集细胞和上清液，细胞流式细胞仪检 测DC表型，上清液-70℃冰箱保存，留作ELISA法检测分泌的细胞因子IL_12、IL_10和TNF_α 。
1.2.2 流式细胞仪检测DC细胞免疫表型：采用直接免疫莹光染色法，在流式细胞仪上检 测分析。收集DC,用PBS液清洗2次，将细胞转移至流式管，用200ul的PBS重悬，调整细胞浓 度1×106，各管分别加入CD45_FITC，CD83_FITC,CD80_FITC，MHCII_PE,CD40单抗各2ul， 各管加入50ul悬液，设立空白对照组2ul,4℃避光孵育20分钟。CD40单抗管加入CD40二抗_F ITC,4℃避光孵育20分钟。用PBS洗细胞2次，去除未结合的抗体，最后用500ulPBS重悬。至 少 分析2×104个细胞。染色阳性的细胞含量（％）＝阳性波形面积／总波形面积之和×100 。cellQuest软件分析并作图。
1.2.3 细胞因子检测：用ELISA法检测细胞培养上清中IL_12、IL_10、TNF_α的含量。
1.3 统计学分析：采用SPSS 15.0统计软件分析数据，所有数据均以x－±s表示，组间比较采用方差分析。P＜0.05为差异有 统计学意义。
2 结果
2.1 镜下DC的形态：在倒置显微镜下观察，细胞瑞色染色，发现单核细胞未见分叶， 细胞纯度较高。培养第2～3天即可观察到胞质有毛刺，以 后成簇聚集成集落生长，疏松贴壁，呈半悬浮生长，见图1。第5天，集落逐渐增大，之后有 部分衰老坏死，悬浮到培养基的表层。成熟树突状细胞形态见图2。
2.2 流式细胞术检测DC的表型：见表1。
3 讨论
树突状细胞广泛分布于外周淋巴组织，最大限度地捕捉抗原，是启动、调控和维持免疫的重 要环节，决定免疫反应的最终走向。人外周循环存在两种不同的DC亚型，即髓样DC和淋巴样DC。DC从前体到不成熟再到成熟的发育过程中，其形态和表型不断发生变化，这使得鉴定困难。我们认为要结合其形态、表型及功能三方面来鉴定DC。首先，要每天在 倒置显微镜下观察细胞的形态，典型的DC细胞呈胞体拉长、具有树突状突起外形。其次，从 表型上鉴定。DC表达丰富的免疫分子，特别是高表达MHC_II分子（HLA_DR）、CD1a、共刺激 分子(CD80/B7_1、CD86/B7_2、CD40)和细胞间黏附分子。目前国内外鉴定DC通常采用CD1a和 CD83,并以后者作为成熟的标记，但尚未找到一种适合所有DC特异性的表面标志物。本实验联合检测CD40、CD80和CD83，能充分说明成熟树突状细胞的免疫表达，从功能上鉴定 。我们从外周血分离培育后获得髓样DC，在DC产生许多促炎因子中，检测炎症因子IL_12和TNF_α，以及抑炎因子IL_10的分泌，均表明炎症因子有一定的表达量。
胰岛素的生理浓度为1nmol/L,本文以超生理浓度胰岛素（10、100nmol/L)干预正常人DC、 发现胰岛素浓度分别为10nmol/L和100nmol/L组的DC表面标志CD40、CD80和CD83的阳性表达 率较不含胰岛素的阴性对照纪的CD40、CD80和CD83阳性表达率明显升高（P
本实验还发现，胰岛素对DC表面标志物CD40、CD80和CD83的表达、细胞因子IL_12和TNF_α 。 分泌的促进作用随着胰岛素浓度的升高而升高(P＜0.01)；而DC分泌的IL_10则随着胰 岛素浓度的升高而下降（P
本实验是从体外单一因素离体研究，研究角度也仅从免疫炎症出发，作为体内功能最强的抗 原提呈细胞，DC介导的免疫机制可能参与AS的发病，但AS时DC是如何被激活的？具体过程如 何？高浓度胰岛素在体内状况 下对DC的影响及其机制等尚需要更深入的研究。
参考文献
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