黑蜣(Bess beetle)纤维素酶的组分及其特性分析

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摘要以30日龄的黑蜣幼虫为材料，对其整体匀浆后组织液中的纤维素酶组成及活性进行了分析。结果表明：黑蜣体内存在内切β-1，4-葡聚糖酶（Cx酶）、β-葡萄糖苷酶；β-葡萄糖苷酶和Cx酶的最适宜温度为分别为40 ℃和50 ℃；Cx酶和β-葡萄糖苷酶分别在pH值为6.4和5.2时具有最大的活力；β-葡萄糖苷酶和Cx酶的最适宜反应时间为80 min。Cx酶具有比β-葡萄糖苷酶更强的温度适应性，在30～50 ℃温度范围内可维持最大酶活力的66.20%。

关键词黑蜣；纤维素酶；性质；酶活力

中图分类号Q969.516；Q556.2文献标识码A文章编号 1007-5739（2011）03-0017-03

AnalysisonCharacterizationandConstitutionofCellulaseinbessbeetle

CHI Ya-qinZHU Jing *DUAN XuNIE Heng

（Faculty of Conservation，Southwest Forestry University，Kunming Yunnan 650224）

AbstractThe property of major cellulases from the whole body of Bess beetle larvae（30 d）had been characterized. The results showed that the Bess beetle contacted Cx（endo-β-1，4-endoglucanase）and exo-β-1，4-glucanase. The optimal temperatures for exo-β-1，4-glucanase was 40 ℃，and Cx（endo-β-1，4-endoglucanase） was 50 ℃. Endo-β-1，4-glucanase was optimally active at pH value 6.4，while the optimal activity of the exo-β-1，4-glucanase occurred at pH value 5.2.The optimal active time for exo-β-1，4-glucanaseis and endo-β-1，4-endoglucanase was 80 min. The endo-glucanase was active with a wider range of temperature than exo-β-1，4-glucanaseis，the levels of activity from 30 ℃ to 50 ℃ were over 66.20%.

Key wordsBess beetle；cellulase；characterization；enzyme activity

近年来，以可再生、可代替石化能源的生物质资源为原料生产乙醇的研究课题倍受关注。纤维素作为地球上分布最广、产量巨大、最廉价的可再生资源，如利用当今的生物技术进行能源转换，将能有效缓解石化能源枯竭和环境恶化的问题。如何高效低成本地生产生物乙醇是这类研究的关键问题。利用当前酶解法来降解纤维素、以高活性的酶使得短时间内糖化率得以提高成为乙醇生产中极为重要的一步。为获得高活性的纤维素酶，研究者们从具纤维素酶特性的微生物和动物中进行了大量的筛选工作。同时，对以获得的较高活性的纤维素酶施以遗传工程改造，以期进一步提高酶的活性，生产高活性的纤维素酶产品[1]。

最初，人们普遍认为动物自身不含纤维素酶，食木性的节肢动物以及草食性动物是通过体内共生生物来利用纤维素的[2]。但随着研究的深入，人们逐渐发现动物体内的纤维素酶与其体内的生物并没有直接关系。Scrivener等[3]研究食木蟑螂（Panesthia cribrata）时发现纤维素酶活性只在其前肠和中肠中存在，而在大量原生生物存在的后肠中却未检测到纤维素酶的活力。该试验提示，食木蟑螂很可能具有内源性的纤维素降解能力。1998年Watanabe等[4]利用白蚁（R.spertaus）的内切β-1，4-葡聚糖酶的抗血清对其cDNA文库进行免疫筛选等方法，进一步证实了动物体内确实存在内源性的纤维素酶并具有较高的活性。为了在食大量纤维素的昆虫中获得更高活性的纤维素酶，研究者们不断地从不同来源和种类的昆虫中寻找纤维素酶，以扩展纤维素酶的资源。在甲壳虫[5]、白蚁[6]、线虫[7]、蟑螂[8]等动物体内克隆得到了纤维素酶基因。但目前尚未见有关黑蜣纤维素酶的研究报道。

黑蜣（Bess beetle）属鞘翅目（Coleoptera）黑蜣科（Pass-alidae）甲虫，约500种，多见于热带，但也有一些分布于北美洲；鞘翅黑色，有光泽，故又称漆皮甲虫；栖于腐木的树皮下，取腐木为食[9]。本研究根据黑蜣取食腐木的特性，推测其体内可能具有消化纤维素的酶存在，并对其存在的纤维素酶的组分和特性给予分析和鉴定。同时，探讨了温度、pH值和时间对黑蜣纤维素酶活性的影响，为今后纤维素酶的来源增加新的家族和类型。

1材料与方法

1.1试验材料

试验所用黑蜣幼虫采自云南省西双版纳景洪市大渡岗，饥饿2 d后于超低温（-70 ℃）冻存，备用。试剂：水杨素（Salicin）（上海源聚生物科技有限公司实验试剂）；羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、微晶纤维素（MC）（国药集团化学试剂有限公司化学纯）；3，5-二硝基水杨酸（成都科龙化工试剂厂产品）；苯酚、酒石酸钾钠（天津市化学试剂三厂产品）；重铬酸钾（重庆川江化学试剂厂实验试剂）。

1.2试验方法

1.2.1粗酶液的提取。参照殷幼平等[10]的方法，取供试黑蜣幼虫若干只，称其质量，以总质量为标准加入10倍乙酸-乙酸钠缓冲液（0.2 moL/L，pH值4.6）进行整体冰浴匀浆，匀浆液用Eppendorf管分装，迅速在4 ℃、12 000 r/min条件下离心10 min，取上清液作为测试用粗酶液，贮于-30 ℃冰箱中备用。

1.2.2纤维素酶的活性测定。利用DNS法测定纤维素酶的活性，分别以1% MC、1% CMC-Na和1% Salicin为底物测定45 ℃下外切β-1，4-葡聚糖酶（C1酶）、内切β-1，4-葡聚糖酶（Cx酶）和β-葡萄糖苷酶的活性[11]。3 种底物均用乙酸-乙酸钠缓冲液（0.2 moL/L，pH值4.6）配制。取上述底物0.95 mL、粗酶液的5倍稀释液0.05 mL混匀，在45 ℃水浴保温1 h后，加入DNS显色剂1.5 mL，迅速在沸水浴条件下显色5 min，冷水浴冷却，再补入0.5 mL双蒸馏水。混匀后于550 nm处测定其OD值，每处理重复3 次，同时设空白对照。以试验条件下单位时间酶促反应生成的还原糖量计算酶活性（μmoL葡萄糖/min）。

1.2.3纤维素酶性质的测定。①最适pH值的测定。以pH值为2.2、2.8、3.4、4.0、4.6、5.2、5.8、6.4、7.0、7.6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（0.2 moL/L）配制底物，测定方法同上。以pH值为横坐标、纤维素酶活力为纵坐标建立pH值影响曲线。②最适作用温度的测定。分别以20、30、40、50、60、70、80、90 ℃恒温水浴条件下，以粗酶液与预热5 min的3种底物溶液各反应1 h后进行酶活性测定，测定方法同上。以温度为横坐标、纤维素酶活力为纵坐标建立反应温度影响曲线。③最适反应时间的测定。酶液与3种底物混匀放入45 ℃中水浴分别反应10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 min后测定其活性，测定方法同上。以时间为横坐标、纤维素酶活力为纵坐标建立反应时间影响曲线。④热稳定性测试。酶液分别放入30、40、45、50、55、60、65、70、80 ℃水浴中加热1 h后测定其活性，测定方法同上。以时间为横坐标、纤维素酶活力为纵坐标建立热稳定性曲线。

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2结果与分析

2.1黑蜣体内纤维素酶的组成

在试验条件下检测到了黑蜣幼虫2种纤维素酶的活性，分别是Cx酶和β-葡萄糖苷酶，且在相同的条件下Cx酶的活性大于β-葡萄糖苷酶的活性。Cx酶的活性为2.870 μmoL葡萄糖/min；β-葡萄糖苷酶的活性为 1.889 μmoL葡萄糖/min。

2.2pH值对黑蜣幼虫纤维素酶活性的影响

由图1可知，溶液中pH值的变化对2种纤维素酶活性的影响较为明显。Cx酶在pH值6.4时达到最大值，为2.722 μmoL葡萄糖/min。β-葡萄糖苷酶在pH值5.2时活性最大，为1.759 μmoL葡萄糖/min。β-葡萄糖苷酶的pH值适宜范围为4.6～6.4，酶活性为1.370～1.759 μmoL葡萄糖/min；Cx酶具有更宽的pH值适应范围，为4.0～7.0，酶活性为2.444~2.722 μmoL葡萄糖/min。但是2种酶的适宜范围都在4.6～6.4，超过这个范围，酶的活性均偏低。

2.3温度对黑蜣幼虫纤维素酶活性的影响

由图2可知，随着温度的升高，幼虫的β-葡萄糖苷酶和Cx酶均有升高的趋势。在20～60 ℃范围内随温度的升高，2种酶活性增高。当温度达到一定程度后，2种酶的活性均开始减弱，并表现出反应体系的温度越高，酶的活性越低小的规律。同时还表明，2种酶各自具有适宜的作用温区，Cx酶的适宜温区为40～50 ℃，酶活性为3.981 0～4.018 6 μmoL葡萄糖/min，并在50 ℃时具有最高的酶活性；而β-葡萄糖苷酶适宜作用温区为 40～50 ℃，酶活性为2.056~2.269 μmoL葡萄糖/min，最适宜作用温度为40 ℃。

2.4反应时间对黑蜣幼虫纤维素酶活性的影响

由图3可知，Cx酶和β-葡萄糖苷酶在反应时间达到80 min时，葡萄糖生成量基本趋于平衡，不再随时间增加而增加。反应80 min时，Cx酶活性达3.324 μmoL葡萄糖/min，β-葡萄糖苷酶活性达2.583 μmoL葡萄糖/min。

2.5纤维素酶热稳定性测试

表1是黑蜣幼虫纤维素酶的重要组分Cx酶和β-葡萄糖苷酶在温度梯度下的酶活性测定值及酶活性下降值（与原酶活性T0比较）。由表1可知，Cx酶具有较强的热稳定性，30 ℃下处理1 h，酶活性变化较小（仅下降5.92%）；50 ℃下加热1 h，酶活性仅下降33.80%；55 ℃为Cx酶活性热稳定性变化的第1转折点，在此温度下处理1 h，酶活性仅存48.05%；65 ℃是Cx酶活性变化的第2转折点，在此温度下处理1 h，酶活下降了75.64%；70 ℃下加热1 h，酶活性已很低（只有原酶活性的3.14%），几乎完全丧失。与Cx酶相比，β-葡萄糖苷酶的热稳定性显然差得多。30 ℃处理后酶活下降了9.42%，在50 ℃的温度下加热1 h，酶活下降47.70%；60 ℃下加热1 h，酶活性只有原酶活性的20.01%；70 ℃下加热1 h，酶活性只有原酶活性的3.12%，几乎完全丧失。

3结论与讨论

3.1黑蜣纤维素酶的活性组

目前，有关纤维素酶降解纤维素的机理仍未完全阐明，多数学者普遍认为纤维素酶对纤维素的降解是各种组分相互协同作用的结果。按照C1～Cx协同理论的解释，纤维素的降解需要在3种酶的协同作用下才能完成[12]。但实际上在研究过程中发现，有些Cx 酶能在纤维素链上随意打开缺口后继续作用，进一步降解纤维素，有些C1酶也不是单纯地作用于Cx提供的纤维片段末端，而是本身就能在纤维素长链上打开缺口，开始新的降解过程[13]。

近来已有研究表明，某些天牛和白蚁既能取食树木的韧皮部，也能取食木质部，且肠道内均有完整的纤维素酶系，并以此获得生存所需的能量[14-15]。而黑蜣取食的食物（如腐木）其纤维素结构相对松散，容易分解。这或许是天牛和白蚁能具有完整的纤维素酶系而黑蜣仅具有Cx酶和β-葡萄糖苷酶的原因。

3.2黑蜣纤维素酶的性质

本文研究了黑蜣纤维素酶最适pH值、最适宜的温度、最适反应时间及热稳定性，分析结果表明：黑蜣幼虫具有纤维素酶中的2个组分，即Cx酶和β-葡萄糖苷酶。在pH值为5.2的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（0.2 moL/L）条件下，Cx酶和β-葡萄糖苷酶2种纤维素酶具有较高的酶活水平。纤维素酶是种复合酶系，适当地将pH值控制在一定范围内，则可使纤维素酶系中某一组分的功能得到有效发挥。

与天牛和白蚁相比较，黑蜣纤维素酶对温度比较敏感，特别是Cx酶，在40～60 ℃时酶活水平比较高，而在较高温和较低温下酶的活性显著降低，在50 ℃条件下，水浴反应1 h后，酶活达到最大值，说明在此温度下黑蜣纤维素酶保持稳定且具有较高活性。在热稳定性的测试方面，该酶50 ℃以下具有较好稳定性，这表明黑蜣纤维素酶为优良的耐热性纤维素酶，在生产应用方面显示了良好的应用前景。

黑蜣是一个未见报道的具纤维素酶的物种，从对该物种纤维素酶活性的影响因子（pH值、温度、反应时间及热稳定性）的分析研究，为将来的高活性纤维素酶筛选提供了基础数据。本实验室对中国圆田螺和松墨天牛体内纤维素酶进行过研究[16]，与前两者相比较，在相同的条件下，黑蜣纤维素酶具有更广的温度适宜范围，酶的高效性和专一性更显现。同时，该研究还表明黑蜣具有不完全的纤维素酶系，至于这些纤维素酶是黑蜣自身分泌的还是来源于体内共生微生物，亦或是两者协同作用的结果，需要通过进一步的研究加以证实。

4致谢

感谢昆明理工大学孟庆雄教授、中国科学院昆明动物研究所李文辉教授给予该研究许多宝贵的意见！

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