RNAi介导抗水稻条纹病毒转基因水稻的培育

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摘要：本研究根据RNA干扰的机制原理，利用已构建的包含SP基因部分片段反向重复序列和生物安全性更高的标记基因bar基因的rnai双元表达载体pDTRSV-IRSP-Bar，通过采用农杆菌介导的方法转化水稻愈伤组织获得抗条纹叶枯病和抗除草剂的转基因水稻植株，通过Basta抗性筛选、PCR检测及Northern blot分析，获得了稳定高抗RSV和抗Basta的株系KRSV1和KRSV9，并对其田间抗性及农艺性状表现进行了调查研究。

关键词：水稻条纹病毒；RNA干扰；反向重复序列；农杆菌介导

中图分类号：S511.2+23.53文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）05-0038-04

水稻条纹病毒（Rice stripe virus，RSV）是纤细病毒属（Tenuivirus）的代表成员，由介体灰飞虱以持久性方式经卵传播，该病毒引起的水稻条纹叶枯病具有分布范围广、危害极严重的特性。在水稻条纹叶枯病流行暴发年份，能造成水稻大面积减产甚至绝收，化学防治对其效果不明显，并且造成环境污染。因此，选育抗病品种是防治水稻条纹叶枯病的最经济有效的方法。

RSV是一种特殊的多组分RNA病毒，其中日本T分离物全基因组序列已被测定，全长为17 145 nts， 由4条单链RNA组成，按照分子量由大到小分别命名为RNA1～RNA4[1～3]。RSV具有独特的基因组结构和编码策略，除RNA1采用负链编码策略，vcRNA1编码依赖RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase， RdRP）外，RNA2、RNA3、RNA4均采取双义编码策略，其中确定与病毒致病力和侵染过程密切相关的是RSV vcRNA3编码的病毒外壳蛋白（coat protein， CP）和vRNA4编码的病害特异性蛋白（specific protein，SP）[4～6]。

目前抗RSV品种的培育主要是通过常规育种结合分子标记辅助选择，但存在抗性资源缺乏、育种周期长、效率低等问题。随着近年来RNA干扰（RNA interference， RNAi）机制研究的不断深入，利用RNAi的高效性和特异性来控制植物的病毒病已开始得到重视和应用[7]。生物学研究表明，RNAi是由内源性或外源性双链RNA （dsRNA） 所导致的细胞内特异性的基因沉默的现象，主要借助转录后的加工特异性地降解靶标RNA而使基因失活，从而获得对病毒的抗性，所以也称为转录后基因沉默（Post-transcription gene silencing， PTGS）[7，8] 。dsRNA的形成存在多种可能的途径[9]，但许多研究表明，在植物体内产生dsRNA的最佳方法是转化具有发夹结构 RNA（hairpin RNA， hpRNA）的外源基因。具有发夹结构的外源基因由两段反向重复（Inverted repeat， IR）DNA序列和一段其他DNA（spacer）序列组成，两段IR DNA由spacer连接起来，这样的结构所转录的RNA会形成hpRNA。基于hpRNA表达而诱导的基因沉默已在多种生物、基因上获得成功[10～13]。因此通过体外构建hpRNA可以高效地诱发基因沉默。

本研究利用已构建的包含SP基因部分片段反向重复序列和bar基因的RNAi双元表达载体pDTRSV-IRSP-Bar，通过采用农杆菌介导的方法转化水稻愈伤组织获得抗条纹叶枯病和抗除草剂的转基因水稻植株，经Basta抗性筛选、PCR检测及Northern blot分析，获得了高抗RSV和抗Basta的水稻植株，为水稻抗RSV品种的培育奠定了基础。

1材料与方法