何首乌饮对衰老大鼠脑组织细胞Rb/p53表达的影响

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[摘 要] 目的 检测rb、p53在衰老大鼠脑组织中的表达，探讨何首乌饮抗大鼠脑组织衰老机制。方法 选用8周龄SD大鼠84只，体重180-220克，随机分为正常组、模型组、何首乌饮高、中、低剂量组、何首乌丸剂组、自然恢复组，每组12只，采用D一半乳糖连续腹腔注射建立亚急性衰老大鼠模型。采用免疫组织化学、Western blotting和RT-PCR法检测pRb、p53在大鼠脑组织的表达差异。结果 模型组大鼠脑组织Rb、p53表达明显增加，pRb表达明显减少（P

关键词：何首乌饮 Rb p53 脑组织 衰老 免疫印迹法 RT-PCR 大鼠

中图分类号：R453 文献标识码：B 文章编号：1004-7484（2010）11-0003-03

近年来从分子生物学角度研究细胞衰老，特别是衰老期间有关基因及其调控变化[ 1-3]，已成衰老机理研究的主要方向。细胞衰老过程是借助于信号转导通路阻滞实现的[ 4-5 ]，其中Rb/p53细胞转导通路至关重要[6-7]。

补肾方剂何首乌饮由刘河间《宣明论方》何首乌丸加味而成，具有补肝肾、益精血、延年益寿之功效。何首乌饮具有提高脑细胞的增殖能力 [8-9]。本研究通过观察何首乌饮对亚急性衰老大鼠脑细胞信号转导通路p53/Rb蛋白表达变化，探讨何首乌饮抗脑衰老的作用机制。

1 材料和方法

1.1 药品与试剂

D一半乳糖，北京化学试剂公司；何首乌饮方剂；p53、pRb、β-actin单抗，Santa Cruz公司；预染蛋白分子量标准，上海吉泰新绎生物科技有限公司；SP免疫组织化学试剂盒、HRP一羊抗鼠lgG，北京中杉金桥生物技术有限公司；细胞裂解液、二喹林甲酸 （BCA）蛋白定量试剂盒，p53、Rb、β-actin引物，上海生工生物工程技术服务有限公司；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，Amersham公司；增强型化学发光（ECL）检测试剂盒，北京泰格美生物有限公司；UNIQ一10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒，杭州博日科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 药物准备：何首乌饮方剂由何首乌（炙）、肉苁蓉、怀牛膝、淫羊霍、丹参、茯苓按3：2：3：2：5：3配比，何首乌丸方剂由何首乌（炙）、肉苁蓉、怀牛膝按3：2：3配比。两药分别加5倍蒸馏水浸泡1h，水煎2次，每次30min，滤过。两次滤液合并，浓缩至含生药分别为2.06、2.40、4.80、9.60 kg/L（分别作为丸剂，低、中、高剂量药液）。4℃保存，给药前复温至25℃～30℃。

1.2.2 建立模型及分组：选用8周龄清洁级SD大鼠84只（由河北医科大学实验动物中心提供），雌雄各半，体重180～220克，随机分组。正常组（N）12只，腹腔注射生理盐水（0.5mL/100g）60d，其余动物用生理盐水配制的6%D•半乳糖溶液[按300mg/（kg•d）]连续腹腔注射60d。进行Morris水迷宫行为学实验判断造模是否成功。将造模成功的亚急性衰老大鼠随机分为模型组（M）、何首乌饮低剂量（Td）组、何首乌饮中剂量（Tz）组、何首乌饮高剂量（Tg）组、何首乌丸剂（Tw）组、自然恢复（SR）组，每组12只。药物灌胃，自然恢复组每天灌胃等量的生理盐水，连续60d。

1.2.3 标本的采集及处理：大鼠用10%的水合氯醛麻醉，断头取出脑组织，迅速投入到液氮中待用。

1.2.4 免疫印迹：将一定量脑组织加入预冷的0.01moL/L PBS液（含lmmoL/L NaF）中匀浆，4℃，3 000r/min离心5min，弃上清。在沉淀中加入细胞裂解液，冰上反应40min，每5min振荡30s，40C，12 000r/min离心20min，取上清，一20℃备用。用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。蛋白变性，上样，SDS-PAGE电泳，恒流电转至PVDF膜上。5%脱脂牛奶室温封闭2h。pRb一抗（1：200）孵育4℃过夜。TBST洗膜3次，10min/次。加入HRP标记的羊抗鼠IgG（1：1 000），摇床室温孵育1h，TBST洗膜3次，5min/次。ECL检测试剂盒显色2min，暗盒中曝光1～3min，显影、定影。将条带扫描后输入图像分析系统，结果与β-actin蛋白表达水平相比较，用软件Bandscan5.0进行灰度分析。

1.2.5 RT―PCR检测p53、Rb mRNA表达：将标本从液氮中取出，按UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒操作，提取总RNA。取2μg总RNA为模板逆转录成cDNA。取2μl逆转录产物以β-actin为内参照进行PCR扩增。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳观察结果、照相，用凝胶图像分析系统分析结果，分别计算各实验组大脑皮质组织条带的光密度与相对的β-actin条带光密度的比值（该值为各目的基因mRNA表达的相对水平）。

1.3 统计学分析

用SPSSl 1.0软件进行统计学处理，测定各实验组的结果用均值4-标准差（孟4-s）表示，采用t检验，两两之间用q检验。

2 结果

2.1 p53、Rb基因的mRNA表达

模型组p53、Rb mRNA 的表达明显高于正常对照组（ P < 0.0 1），与自然恢复组无差异（ P > 0.05 ）；何首乌饮、何首乌丸组大鼠大脑皮质 p53、Rb mRNA 的表达明显低于模型组（P < 0.01）。其中何首乌饮高剂量组明显好于其余各组（P < 0.05）。

2.2 pRb蛋白的表达

模型组大脑皮质 pRb 蛋白表达明显下降，与正常组比较有显著性差异（ P 0.05）；何首乌饮、何首乌丸组大鼠脑皮质 pRb 蛋白表达明显高于模型组 （ P < 0.01 ）。其中何首乌饮高剂量组明显好于其余各组（ P < 0.05），见表1，图1，2，3。

3 讨论

衰老细胞周期常阻滞于G1/S期或G2/M期，尤其是G1末期的限制性调控点“R”点的阻滞。

Rb蛋白对细胞周期中最关键的调控点G1/S期、G2/M期起着“闸门”的作用，Rb蛋白的磷酸化和非磷酸化最终决定细胞周期的进程。近来发现，抑制素诱导细胞衰老也是通过E2F 实现的[10] 。E2F只有在与Rb蛋白分离，处于游离状态时才能成为调控细胞周期的转录因子，E2F能活化与DNA合成密切相关的重要酶类基因的转录，使细胞从G1期进入S期。

抑癌蛋白p53 可以导致细胞周期停滞或者细胞凋亡[ 11 ]。p53 在细胞浆中可以通过泛素-蛋白酶体通路降解，mdm2往返细胞核与细胞浆之间，当mdm2- p53 复合物由细胞核进入细胞浆时，p53 发生降解而mdm2返回细胞核，故细胞核输出mdm2对p53的降解非常重要。mdm2与 p53 结合后抑制 p53 的转录功能，形成p53-mdm2自身反馈调节循环，结果使 p53 保持低水平。

我们的研究显示：衰老大鼠大脑皮质Rb、p53基因蛋白表达明显升高，pRb蛋白表达明显降低；而何首乌饮能够降低衰老大鼠大脑皮质Rb、p53基因蛋白的表达，明显提高pRb蛋白表达，起到延缓脑衰老的作用。

附图

参考文献

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