番茄灰霉病病株根际土壤宏基因组文库的构建

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摘要：利用宏基因组DNA提取试剂盒提取番茄灰霉病病株根际土壤微生物宏基因组DNA，经PstⅠ和Hind Ⅲ双酶切，回收1-5kb大小的片段，与经过相同酶酶切的PblueScript ⅡKS(+)质粒载体相连接，转入大肠杆菌DH5a，构建了番茄灰霉病病株根际土壤微生物宏基因组文库。

关键词：番茄灰霉病；宏基因组DNA；双酶切；文库

中图分类号：S436.412 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2011）-04-0104-2

0 前言

番茄灰霉病（Botrytis cinerea）是由半知菌亚门灰葡萄孢属（Botrytis cinerea）真菌引起，是世界性、破坏性极其严重的植物病害之一。目前已成为危害我国温室蔬菜最主要的病害。传统的防治方法以化学农药为主，病原菌非常容易产生抗耐药性，从而使防治效果下降；同时施用农药引起严重的环境污染。近年来人们通过大量筛选并加以改良利用灰霉病拮抗菌及其次生代谢产物，使生物防治技术成为防治植物灰霉病的一条有效的途径。

土壤是微生物的良好生存环境，土壤中的微生物种类丰富，对农业生产和环境保护有着重要作用[1]。传统的研究土壤微生物的方法如微生物纯培养、微生物库(如微生物生物量)和流(c和N循环)、微生物生物标记物(FAMEs)等仅仅能够反映极少土壤微生物的生活特征和生态功能，并不能完全揭示其多样性[2]。科学界普遍认为未培养微生物在自然界土壤栖息群中占99%以上的资源，并逐渐成为微生物学的研究热点。“宏基因组（Metagenome）”是由Handelsman等1998年提出的，即生境中全部微小生物遗传物质的总和，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。宏基因组文库包含可培养和未能培养微生物的基因，避开了微生物分离培养的瓶颈，扩大了微生物资源的可利用空间[3]。

1 材料与方法

1.1 材料

E．coli DH5c，由山东理工大学丁忠锋老师赠送；土壤DNA提取试剂盒，购自美国O―MEGA公司；pBluescript II SK(+)，由购于第三军医大学蒋国成老师赠送；T4DNA ligatase购自美国STRATAGENE公司。

1.2 方法

1.2.1 土壤样品采集及土壤总DNA的提取 土壤样品采自山东省淄博市张店房镇常年种植番茄的温室大棚，用灭菌的小铲取患灰霉的番茄病株根际5-10cm深处的土壤，装入灭菌的纸袋并带回实验室，对采回来的土样进行过筛处理，3mm两次，1mm一次，0.25mm一次,放入远红外恒温快速干燥箱60℃恒温干燥3h,将样品分装于5ml离心管存于4℃。

土壤样品采回后，用土壤宏基因组DNA提取试剂盒并纯化土壤总DNA，根据文献[4]所描述的电泳方法纯化回收基因组DNA。

1.2.2 土壤总DNA的酶切及质粒载体的制备 将提取的土壤总DNA用限制性内切酶PstⅠ和Hind Ⅲ进行双酶切。建立40uL的反应体系：DNA样品l1uL、PstⅠ和HindⅢ各2uL，10×M Buffer 4 uL、ddH2O 21uL。混匀后于37℃水浴45min，于65℃水浴30min 以终止反应，1.2%琼脂糖凝胶电泳, 回收大于2kb的片段，用于酶联反应。

取pBluescript II SK(+)质粒，用PstⅠ和Hind Ⅲ限制性内切酶在37℃酶切45min，1.2%琼脂糖凝胶电泳后回收大约2800bp的DN段。

1.2.3 土壤微生物宏基因组文库的构建 取DNA酶切样品4.5µl，酶切质粒pBluescript II SK(+) 3 µl，T4 DNA ligatase 0.5 µl，T4 DNA ligation Buffer 1 µl，混匀后l6℃放置4 h，4 ℃过夜。取连接液lO µl，加入100 µl感受态细胞，冰浴30min，42℃水浴60s，冰浴2min，加入890µl LB培养基，37℃、180r/min振荡培养1h，对质粒进行复苏培养。吸取培养物150µl均匀涂布到含氨卞的LB平板上，37℃过夜培养。挑取阳性克隆，并用甘油管进行保藏，以用于筛选[5]。

2 结果与分析

2.1 土壤宏基因组DNA检测及酶切验证

取5µl纯化的宏基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳，检测其质量，结果如图1显示土壤总DNA大小约为15000bp。

M：DNA marker，1：Soil total DNA

图1 土壤微生物总DNA

纯化后的宏基因组DNA样品用限制性内切酶PstⅠ和HindⅢ进行双酶切，设置两种不同DNA浓度和不同酶切时间。经过选择，酶切45Min时DNA酶切质量较好，酶切结果如图2。可直接用于酶联反应[6]。

M：DNA marker，1：Soil total DNA，

Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ：products of restriction by PstⅠ and Hind Ⅲ

图2 土壤微生物总DNA及酶切后DNA

将质粒pBluescript II SK(+)用相同酶进行双酶切，反应45min后，酶切结果如图3显示，可直接用于酶联反应。

图3 酶切后的pBluescript II SK(+)

Fig.3 pBluescript II SK(+) by digestde

2.2 宏基因组文库构建及检测

将酶切后的土壤宏基因组样品与pBluescript II SK(+)质粒进行连接[7]，然后转化DH5a 感受态细胞，挑取阳性克隆即得到土壤宏基因组文库[8]。本实验总计从LB平板上挑取了350个阳性克隆。

3 讨论

土壤是微生物的良好生长环境，土壤中含有大量我们没有了解的基因。传统的研究方法只能够反映极少部分的微生物信息，并不能完全揭示土壤微生物的多样性和丰富性。为了更加深入的研究番茄灰霉病病株根际土壤中微生物含有的基因分布情况，本实验采用宏基因组学技术，从土壤中提取到DNA，纯化后进行双酶切，建立了宏基因组文库，文库中含有大量的未知灰霉病拮抗基因，从而为进一步研究和防治灰霉病提供了平台，也对宏基因组技术在实际中的应用提供了一些参考。

参考文献

[1] 李艳艳.论土壤微生物的宏基因组学及其研究进展[J].现代农业科技学报,2008-08-10.

[2] WANG GY,GRAZIANI E,WATERS B,et al.Novel natual products from soil DNA libraries Tn a streptonycete host[J].Org Lett,2000(2):2401-2404.

[3] 孟飞,俞春娜,王秋岩,等.宏基因组与宏基因组学[J].中国生物化学与分子生物学报,2010,02.

[4]贺纪正,张丽梅,等.宏基因组学的研究现状和发展趋势[J].环境科学学报,2008,2.

[5]冯美琴.宏基因组学的研究进展[J].安徽农业科学.2008,

36(2):415-416,479.

[6] DANIEL R.The metagenomics of soil[J].Nature Review Microbiology,2005,3:470-478.

[7] LORENZ P,SCHLEPER C.MetagenomeA challenging source of enzyme discovery[J].Journal of Molecular Catalysis.2002 19/20:13-19.

[8] RIESENFELD C S,GOODMAN R M,HANDELSMAN J.Uncultured soil bacteria are a reservoir of new antibiotic resistance genes[J].Environmental Microbiology,2004,6:981-989.