莪术油对大鼠乳腺癌癌前病变组织中Ki67表达的影响

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摘 要:目的:通过观察莪术油对大鼠乳腺癌癌前病变组织中ki67的表达,探讨莪术油治疗乳腺癌前病变的机理。方法:275只SD大鼠随机分为空白对照组、疾病模型组、三苯氧胺组、康莱特组及莪术油小、中、大剂量组。采用DMBA诱导乳腺癌癌前病变造模,干预治疗4周,第8～14周分4批处死动物,进行病理学及Ki67免疫组化检测。结果:各试验组不同类型乳腺组织中Ki67表达阳性率及阳性细胞阳性率呈递增趋势。非典型增生乳腺组织中,各干预组Ki67表达阳性率均明显低于造模对照组(P

关键词:乳腺癌;癌前病变;莪术油;Ki67

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)01-0048-04

Effect of Zedoray Turmeric Oil for Ki67 in Precancerous Lesion of Rats Mammary

SUN Ziyuan, SONG Aili, LI Jingwei, YIN Yukun,LIU Xiaofei

(Department of Breast Surgery, the Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250011,Shandong,China)

Abstract:Objective:To research the treatment mechanism of Zedoray Turmeric Oil(ZTO) in precancerous lesion of rats mammary by measuring the expression of Ki67.Methods: 275 SD rats were randomly divided into 7 groups: the blank control group(BC), the precancerous lesion model control group(PL), the kanglaite control group (KLT) ,the tamoxifen control group(TAM), the low dose group of ZTO (ZTO-L), the middle dose group of ZTO (ZTO-M) and the high dose group of ZTO (ZTO-H). Animal model of precancerous lesion of rats mammary was induced bye DMBA and was treated by ZTO, KLT and TAM for 4 weeks. All the animals were killed from 8th to 14th week once every two weeks. Examination of histopathology was performed and measured the expression of Ki67 by immunohistochemistry.Results: The positive rate of expression of Ki67 and the positive-cell rate trend to increase in every groups except BC corresponding to normal, usual ductal hyperplasia(UDH), atypical ductal hyperplasia(ADH) and invasive carcinoma. In ADH, the positive rate of expression of Ki67 of ZTO, KLT and TAM was much lower than PL(P

Key words:Breast cancer; Precancerous Lesion; Zedoray Turmeric Oil; Ki67

乳腺癌癌前病变即非典型增生阶段发生浸润性癌的风险明显升高[1],如何早期干预,阻断或逆转浸润性癌的发生,是降低乳腺癌发生率的关键。中药莪术提取物莪术油,含莪术醇、β-榄香烯、莪术酮等多种成分,对于乳腺癌、肝癌等多种恶性肿瘤具有多靶点抗肿瘤作用[2]。增殖细胞核内抗原Ki67能够确切的反映肿瘤细胞增殖活性,与乳腺癌的发展及预后相关[3]。本研究通过检测不同干预条件下DMBA诱导大鼠乳腺癌前病变造模组织中Ki67蛋白的表达,初步探讨莪术油对大鼠乳腺癌癌前病变组织细胞增殖活性的影响及干预作用。

1 实验动物及材料

1.1 实验动物

健康未育SD系雌性大鼠275只,鼠龄为出生后6周,体重190～235g,由中国科学院上海实验动物中心提供,质量许可证号SCXK(沪)2003-0003。常规饲养1周,适应环境后开始实验。

1.2 药品及试剂

(1)二甲基苯蒽(Sigma公司生产,产品编号165023),5g/支,按10mg:1mL比例溶于500mL芝麻油,备用;(2)莪术油注射液(每支0.1g/10mL,哈尔滨三联药业有限公司,国药准字H20053467);(3)康莱特注射液(100mL/瓶,浙江康莱特药业有限公司,国药准字Z20030004);(4)三苯氧胺(枸橼酸他莫昔芬片,10mg×60片/瓶,江苏扬子江药业集团有限公司,国药准字H32021472),按10mg:50mL比例溶于生理盐水,备用;(5)脱毛膏(广州市卡美奥化妆品有限公司,批号:K005041302),80g/支;(6)即用型SABC试剂盒、DAB二氨基联苯胺显色试剂盒由上海长岛生物技术有限公司提供;二抗由北京中山金桥生物技术有限公司提供;兔抗人/大/小鼠Ki67抗体(bs-0722R)由北京博奥森生物技术有限公司提供。(7)其他:乙醇、二甲苯、苏木素、伊红等。

1.3 实验仪器

OLYMPUS(BH-2)照像显微镜、光学显微镜,隔水式电热恒温培养箱(PYX-DHS),LEICA RMZ135切片机,微复移液器, WT11001R型电子天平,HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统。

2 试验方法

2.1 分组 造模及给药方法

275只SD大鼠随机分为7组:(1)空白对照组: 35只,一次性灌胃生理盐水1mL/100g;(2)疾病模型组:40只,一次性灌胃DMBA100mg/kg(1mL/100g);(3)莪术油小剂量治疗组: 40只,一次性灌胃DMBA100mg/kg(1mL/ 100g),第2天开始莪术油1mL/100mg腹腔注射4周;(4)莪术油中剂量治疗组: 40只,一次性灌胃DMBA100mg/kg(1mL/ 100g),第2天开始莪术油2mL/100mg腹腔注射4周;(5)莪术油大剂量治疗组: 40只,一次性灌胃DMBA100mg/kg(1mL/ 100g),第2天开始莪术油4mL/100mg腹腔注射4周;(6)康莱特治疗组: 40只,一次性灌胃DMBA100mg/kg(1mL/100g),第2天开始康莱特2mL/100mg腹腔注射4周;(7)三苯氧胺治疗组:40只,一次性灌胃DMBA100mg/kg(1mL/100g),第2天开始三苯氧胺2mL/100mg灌胃4周。造模及给药后各组动物均常规饲养。

2.2 取材及制片

(1)动物观察时点及每批处死动物数量(表1)。(2)取材:脱毛剂将大鼠胸部鼠毛去除,1%戊巴比妥钠按40mg/kg经腹腔注射麻醉后,取大鼠胸腹部第4、5、6对乳腺及其周围皮肤、皮下组织约1.0cm×1.0cm。(3)标本经中尔马林固定梯度乙醇脱水,石蜡包埋切片。

2.3 免疫组化染色方法

石蜡包埋组织切片经常规脱蜡,抗原高压修复, 3%H2O2消除内源性过氧化物酶,山羊血清封闭非特异性抗原,加一抗4℃冰箱过夜,第2天切片恢复室温后,依次加生物素标记的二抗及SABC试剂,DAB显色,苏木精衬染,梯度乙醇脱水,二甲苯透明封片。用已知阳性片作阳性对照,用PBS代替一抗为阴性对照。

2.4 结果判定方法

(1)大鼠乳腺组织病理学诊断标准按2003WHO乳腺肿瘤病理与遗传学分类。(2)Ki67阳性细胞在细胞核表达棕黄色颗粒。高倍镜下选择阳性细胞较多的区域采集3～5个光镜视野,输入到HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统内,在相同的背底和倍体条件下选择相应的参数,进行计算机完全定量分析。阳性细胞阳性率=阳性目标面密度/(阳性目标面密度+阴性目标面密度)。阳性细胞阳性率10%为(+)。

2.5 统计方法

采用SAS 8.0版统计软件分析,检验标准α=0.05。计数资料用χ2检验;计量资料结果用均数±标准差(±s)表示,先进行方差齐性检验,组间差异采用两两q检验。

3 结果

3.1 各试验组中正常乳腺 普通增生 非典型增生 癌组织中Ki67表达阳性率及表达强度(每例标本的Ki67阳性细胞阳性率)均呈递增趋势,见图1、2。

3.2 大鼠不同类型乳腺组织 各试验组Ki67表达阳性率

见表2。普通增生乳腺组织中,各干预组与造模对照组之间Ki67表达阳性率无显著性差异(P>0.05)。非典型增生乳腺组织中,各干预组Ki67表达阳性率均明显低于造模对照组(P0.05)。

3.3 各试验组中 大鼠不同类型乳腺组织中Ki67表达的阳性细胞阳性率见表3。各组非典型增生组织中Ki67表达的阳性细胞率明显高于普通增生(P

3.4 大鼠非典型增生乳腺组织中 Ki67阳性标本的阳性细胞阳性率见图3～8,表4。Ki67表达阳性的样本中,各干预组Ki67阳性细胞阳性率明显低于造模对照组(P

4 讨论

上世纪70年代提出的Wellings-Jensen模型[4],展示了乳腺癌演变从终末导管小叶单位――增生开放的小叶――普通增生――非典型增生――原位癌――浸润性癌――转移癌的组织学连续谱系。WHO2003乳腺肿瘤组织学分类明确的将非典型增生归属为乳腺癌前驱病变。细胞增殖升高和细胞凋亡减少是这一阶段的显著生物学特性[5-6]。本研究采用中药莪术油、康莱特及三苯氧胺,早期干预DMBA诱导的大鼠乳腺癌前病变造模组织中Ki67抗原的表达,从抗细胞增殖的角度来纠正非典型增生阶段的阳性生长失衡,以期能够早期干预或逆转乳腺癌前病变降低乳腺癌的发生。

Ki-67抗原是位于细胞核内的大分子蛋白,于G1期开始表达,在S期及G2期表达增加,至M期达高峰,在细胞分裂晚期很快消失,能确切的反映增殖期细胞活性。研究结果显示,大鼠癌前病变造模乳腺组织中,Ki67表达阳性率从正常、普通增生、非典型增生、癌组织中呈递增趋势,不同类型乳腺组织中Ki67表达的强度即阳性细胞阳性率也呈递增趋势,尤其非典型增生组织Ki67表达的阳性细胞阳性率明显高于普通增生,提示Ki67表达增强可能是乳腺癌发生的早期事件,抑制乳腺导管上皮细胞增殖活性是早期干预、阻断乳腺癌组织学演变的有效靶点。

莪术油的多靶点抗肿瘤机制包括直接细胞毒作用、抑制肿瘤血管生成、抑制肿瘤细胞DNA合成及核酸代谢、诱导细胞凋亡、提高机体免疫保护效应等。国内研究认为[7-8]莪术油可以降低小鼠HepA肝癌细胞Ki67蛋白的表达;可明显抑制DMBA诱导的大鼠乳腺癌芽体、实团、状增生和核分裂相的形成,促进乳腺癌细胞凋亡,但未降低DMBA对乳腺癌的诱导率。笔者既往研究发现[9]莪术油能够降低DMBA诱导大鼠乳腺癌前病变模型中血液黏度,提高微循环灌注量,其效果优于康莱特和三苯氧胺对照组。本研究结果显示,莪术油低、中、高3个剂量组对于正常乳腺组织及普通增生乳腺组织中Ki67的表达无影响,但能够显著降低非典型增生乳腺组织Ki67表达阳性率和表达强度。在降低Ki67表达强度方面,莪术油组效果优于康莱特和三苯氧胺组,尤其对于Ki67表达阳性的标本,表达强度降低更为显著,并且呈剂量依赖效应,莪术油大剂量组明显优于小剂量组。由于本研究采取最长饲养14周分期处死动物的设计以及莪术油干预剂量的不同,全部10例浸润性癌的发生率无法与前文数据相比较。但是莪术油能够有效的降低DMBA诱导大鼠乳腺癌前病变组织中上皮细胞的增殖活性,为临床治疗乳腺非典型增生提供了一个有效的方法。

参考文献

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