纹状体内微量灌注Tourette综合征患者血清对大鼠刻板行为的影响

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【摘 要】 目的:根据Tourette综合征(Tourette syndrome,TS)发生的自身免疫机制建立TS大鼠实验动物模型。方法:采用酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测符合DSM-IV诊断标准的TS患者血清中的抗神经抗体滴度;通过微量渗透泵将含有高浓度(0.29±0.06 U/L)抗神经抗体的TS患者血清,以0.5 μL/h的速度缓慢注入大鼠纹状体内。在微量灌注结束后1、7、14、21天观察大鼠刻板动作行为,包括啮咬(用牙齿咬笼子,嚼木屑,无目的咀嚼)、将前爪举到嘴边或面部、舔(不包括理毛)、理毛行为、摇头、摇动爪子、用后腿站立及阶段性的发声,将所观察到的各项动作行为计数及其总和作为评估刻板运动的指标。结果:选取抗神经抗体浓度最高的8例TS患者血清和浓度最低的8例对照血清用于造模实验[(0.29±0.06 )U/L vs.( 0.10±0.04) U/L,P

【关键词】 tourette 综合征;动物模型;刻板行为;抗神经抗体

中图分类号:R748,R749.94 文献标识码:A 文章编号:1000-6729(2010)001-0069-05

doi:10.3969/j.issn.1000-6729.2010.01.省略

【Abstract】 Objective:To establish animal model on the basis of the autoimmune etiology for a subset of cases of Tourette syndrome.Methods:Blood samples were drawn from patients with TS(by DSM-IV)and were sent for further enzyme-linked immunosorbent assays(ELISA)to a laboratory.Eight serum samples with the highest concentration of anti-neural antibody were selected for TS model group,and 8 serum sampled with the lowest concentration of anti-neural antibody were selected for the control group.Osmotic mini pump filled with undiluted TS or control serum were microinfused into the rat striatum at a rate of 0.5 μl /h for 72 h.Stereotypic movements were recorded at 1 d,7 d,14 d and 21 d after microinfusion.Several categories of stereotypy including bites(teeth touching the cage,wood chips,vacuous chewing or other objects except the body),taffy pulling(raises of the forepaw to the mouth and face),self-gnawing,licking not associated with grooming,grooming,head shaking,paw shaking,rearing and episodic utterances(EU)were recorded.Results:The anti-neural antibody serum concentration used for TS model was(0.29±0.06) U/L,and that used in control group was (0.10±0.04) U/L.After infusion of TS sera,stereotypic behaviors in rats was increased significantly[(37.2±7.1) vs.(106.3±11.7),P=0.000].Significant difference were observed in stereotypies scores of TS rats compared to control rats after microinfusion[(106.3±11.7) vs.(31.2±6.2),P=0.000].Conclusion:Stereotypic behaviors are increased in rats after intrastriatal microinfusion of Tourette Syndrome sera under noninflammatory conditions.

【Key words】 Tourette syndrome;animal model;stereotypy;anti-neural antibody

Tourette综合征(Tourette syndrome,TS)是一种儿童期常见的神经行为障碍,表现为多发的运动性和发声性抽动。神经影像学、神经生理学及尸检研究表明TS患者的基底神经节及皮质-纹状体-丘脑-皮质回路和多巴胺神经元功能异常[1-3]。为研究TS的发病机制,探讨有效的治疗方法,多数研究工作首先要建立能够模拟人类TS行为学和病理学改变的动物模型,动物模型是现代精神卫生领域和神经科学研究中重要的研究手段之一,建立动物模型对于了解疾病的病因和发病机制、探索药物作用的机理、开发新的治疗方法等具有重要意义[4-6]。本研究根据TS发生的自身免疫机制,采用将TS患者的血清立体定向注射到大鼠纹状体内的技术,来建立TS实验动物模型。

1 对象和方法

1.1实验动物

7周龄Wistar 大鼠24只,雌雄各半,体重260 g~275 g,由山东大学动物实验中心提供。环境温度(21±1 )℃,12 h∶12 h的光/暗循环,自由采食及饮水。大鼠被随机分为对照组(微量注射正常儿童血清)及TS组(微量注射TS患者血清),每组大鼠雌雄比为1∶1。

1.2主要仪器

大鼠脑立体定向仪(Hamilton,美国),植入式微量渗透泵(Alzet,美国),5 μl微量注射器(Hamilton,美国),外科手术器械及手术用敷料(无锡医疗器械厂,中国)。

1.3血清标本收集及抗神经抗体检测

选取20名符合DSM-IV诊断标准的TS儿童和20名正常健康对照儿童。TS 儿童组中男14例,女6例,年龄范围7~13岁,平均年龄为(11.2±1.7)岁;以单纯TS组为病例对照组,其中男13例,女7例,年龄范围8~13岁,平均年龄为(11.7±2.1)岁。两组儿童均抽取静脉血2.5 mL,分离血清后做酶联免疫吸附实验,根据Singer等[7]的方法检测抗神经抗体滴度。取大鼠尾状核进行匀浆,12000 r/min离心30 min,最后用1 mL Tris提取缓冲液将沉淀重悬;取无菌的96孔ELISA平板,每孔加入150 μL 大鼠尾状核匀浆膜蛋白,4 ℃过夜;用含有0.05% Triton-X-100的PBS冲洗,加入15 %的小牛血清,37 ℃下放置2 h;洗板后加入1∶250稀释的待检血清,室温下放置90 min;加入二抗,兔抗人IgG按1∶5000稀释;TMB试剂盒检测抗原抗体反应;在OD=450 nm处读数。

1.4大鼠纹状体微量注射程序

本实验根据文献报道方法,采用血清微量灌注技术制备TS大鼠模型[8-9]。用10 %水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(400 mg/kg)后将其固定于立体定向仪上,采用无菌手术操作技术,将L-形的套管植入大鼠脑内,套管植入位点的三维坐标:即前囟前2.0 mm,正中线左右4.0 mm,颅下7.0 mm。用牙科粘固粉固定套管,并严格按照外科手术无菌操作缝合伤口。

套管植入后让大鼠恢复1周以重建血脑屏障的完整性。1周后在无菌条件下,将渗透泵连接到套管上,泵内充满PBS,内含50 μL未稀释血清的无菌聚乙烯管与渗透泵相连。以0.5 μL/h的速度缓慢注射血清,注射时间持续72 h。每只大鼠被注射不同儿童的血清。注射完成后,用10%水合氯醛再次麻醉大鼠(100 mg/kg,i.p.),再次固定大鼠于立体定向仪上。沿颅正中线切开皮肤暴露大鼠颅骨,取出渗透泵及套管,缝合伤口,将大鼠放于保温垫上直至苏醒。大鼠术后存活情况良好。 1.5大鼠刻板动作的评估

在每个12 h光循环的最后30 min观察大鼠的动作行为。根据文献所述[8-9],所记录的刻板行为如下:啮咬(用牙齿咬笼子,嚼木屑,无目的的咀嚼)、将前爪举到嘴边或面部、自咬、舔(不包括理毛)、理毛行为、摇头、摇动爪子、用后腿站立、阶段性的发声(episodic utterence,EU)。在微量灌注后1、7、14天和21天纪录大鼠的刻板行为。理毛行为按照此类行为发生的时程进行记录。EU是指大鼠在短时间内重复的中等音调的发声。将所观察到的动作行为的总数作为总分。

1.6统计方法

用 SAS 9.0(Statistical Anlysis System)统计软件处理数据,微量灌注TS血清前后大鼠的刻板行为比较采用配对样本t检验,TS组及正常组间比较采用两个样本t检验,检验水平为α=0.05。

2 结 果

2.1 TS患者及正常儿童抗神经抗体ELISA分析

20例TS患者血清抗神经抗体滴度高于健康对照[(0.23±0.07) U/L vs.(0.14±0.06) U/L,t=4.36,P=0.001],选取浓度最高的8例TS患者血清和浓度最低的8例对照血清用于造模实验[(0.29±0.06) U/L vs.( 0.10±0.04 )U/L,t=7.45,P

2.2大鼠刻板行为评估

对TS 病人的血清学检测发现有抗神经抗体的存在,可致纹状体功能受损[10-12]。本研究采用纹状体内微量灌注TS血清成功诱导出大鼠的刻板行为。在微量灌注血清后1、7、14天和21天时监测大鼠的刻板行为,每次的监测时间为30 min。两组大鼠的刻板行为随时间的变化情况见图1。微量灌注TS血清3周后,大鼠的刻板行为显著增加(表1)。灌注结束3周后,灌注TS儿童血清的大鼠的刻板行为与灌注正常儿童血清的刻板行为之间差别显著,TS大鼠的啮咬,将前爪举到嘴边或面部,自咬,舔,摇头,摇动爪子,用后腿站立,阶段性的发声(EU)明显增加(表2)。在安全的环境中,正常大鼠通常并不发出人耳所能听到的声音,而是通过超声波联系[8];EU是由于TS大鼠呼吸道肌肉的突然的不自主的收缩而致,本实验中观察者在离鼠笼2 m远的地方可以听到TS大鼠发出的EU。

3 讨 论

TS是一种复杂的慢性神经精神障碍,表现为不自主的、重复快速的、无目的的肌肉收缩,从而产生刻板的行为(运动抽动)或声音(发声抽动),症状严重程度不一,轻者可不被人们所注意,严重者不仅干扰患者日常生活学习和工作,损害患者的认知功能和发育,影响其社会适应能力,甚至可危及患者生命[13-14]。近年来TS患病率有增加趋势,迄今为止TS的确切病因及发病机制尚未明确。

TS发生的免疫假说即分子模拟假说引起了人们极大的兴趣。免疫学的异常可以解释部分易感人群发生TS的潜在机制。Swedo等人提出了与链球菌感染有关的儿童自身免疫神经精神障碍(Pediatric autoimmune neuropsychiatric disorders associated with streptococcal infections,PANDAS)学说,是为那些突然发生和可能由A组链球菌感染触发OCD和TS症状的儿童而假定的一个发病机制模式。TS的发生在病理生理上与纹状体的自身免疫密切相关。链球菌并非直接进入脑内,最终导致TS发生的可能是某些能够进入中枢神经系统随后导致神经组织功能障碍或损害的免疫成分[15]。

研究发现部分TS患者抗链球菌M12和M19蛋白抗体滴度增加,M蛋白是A组链球菌的主要毒性因素,能与包括大脑组织在内的人体组织抗原决定簇发生免疫交叉反应,在患者的血清中发现有增高的抗基底神经节抗体(anti basal ganglia antibody,ABGA),提示链球菌感染后自身免疫机制可能参与了TS的发病过程[6-7]。链球菌M蛋白的氨基酸序列和基底神经节的抗原有同源性,溶血性链球菌进入机体后,可被免疫系统识别而引起免疫应答,产生的抗体除针对外来抗原外,还可能通过分子模拟机制识别人体正常的基底神经节组织并产生交叉反应,导致ABGA的出现,从而引起抗神经元抗体介导的中枢神经系统功能障碍,导致运动和行为异常[10]。本实验成功建立的自身免疫TS模型,与Hallett[8]、Taylor[9]等的研究结论一致。

目前对TS动物模型的研究相对较少,主要有药理学模型、自身免疫模型、神经回路发育缺陷动物模型及感觉运动门控缺失动物模型等,这些模型从不同方面反映了TS的可能发病机制[4-5]。与其他动物模型相比,自身免疫TS动物模型的优点在于:其不仅可表现出运动性的刻板行为,还可表现出发声性的刻板行为,能够达到良好的表现效度;可以表现出长期的刻板行为;其通过直接注射TS患者的血清来建立,与临床密切相关。

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2009-02-15收稿,2009-08-19录用