膜联蛋白Ⅰ在非小细胞肺癌中的表达及临床意义
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[摘要] 目的 探讨膜联蛋白Ⅰ（Annexin Ⅰ）在非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）中的表达及临床意义。方法 应用免疫组化法检测79例非小细胞肺癌中Annexin Ⅰ蛋白表达水平。 结果 在79例非小细胞肺癌组织中，有40例为Annexin Ⅰ高表达（50.6%），鳞癌为包膜表达，腺癌为包膜表达或包膜与胞浆均有表达，但以包膜表达为主。Annexin Ⅰ表达水平与非小细胞肺癌患者的淋巴结受侵相关（P = 0.022，P ＜ 0.05），而与性别、年龄、病理类型、分期均无明显相关性（P ＞ 0.05）。Annexin Ⅰ阳性表达患者和阴性表达患者的疾病进展时间（time to progression，TTP）差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 Annexin Ⅰ在肺鳞癌，肺腺癌中的表达均上调，可能与肺癌的发生、发展及转移相关,有望成为肺癌早期诊治的理论依据。
[关键词] 膜联蛋白Ⅰ；非小细胞肺癌；转移；免疫组化
[中图分类号] R734 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）05（b）-0077-03
膜联蛋白Ⅰ（Annexin Ⅰ）属于膜联蛋白家族中的成员之一，又被称为Annexin A（Annexin-1，Anx-1），属于钙离子依赖的磷脂蛋白超家族，是第一个被鉴定的Annexins家族成员。Annexin Ⅰ是表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor，EGFR）络氨酸激酶磷酸化的底物，能在上游特异性的调节细胞外信号控制的激酶级联反应，同时还参与细胞信号的传导、细胞迁移、细胞分化、增殖、细胞与细胞之间及细胞与间质之间的相互作用，与肿瘤的转移相关[1]。大量证据表明，不同组织来源的正常的及其肿瘤组织中的乳腺癌、前列腺癌、大肠癌、肝癌等均有Annexin Ⅰ表达，Annexin Ⅰ在多种肿瘤中的表达呈现组织特异性分布[2]，可能与这些肿瘤的发生、发展及转移有一定相关性。但AnnexinⅠ蛋白在非小细胞肺癌中的相关性研究不多，本研究应用免疫组化分析Annexin Ⅰ在肺鳞癌、腺癌中的表达，评价Annexin Ⅰ表达与临床病理因素的关系，探讨AnnexinⅠ在肺癌发生、发展及转移中的作用。
1 材料与方法
1.1 标本收集
收集2004年1月~2006年12月哈尔滨医科大学附属第三医院病理科存档的79例非小细胞肺癌（NSCLC）的手术组织标本。本研究79例患者中，男41例，女38例；年龄 ＜ 40岁23例， ≥ 40岁56例；鳞癌39例，腺癌40例；淋巴结受侵组46例，无淋巴结受侵组33例；（Ⅰ+Ⅱ）期28例，（Ⅲ+Ⅳ）期51 例。所有患者术前均未接受放、化疗及靶向治疗。本研究得到哈尔滨医科大学附属第三医院伦理委员会批准。
1.2 主要试剂和实验方法
兔抗人Annexin Ⅰ多克隆抗体和免疫组化检测试剂盒，分别购自美国Zymed实验室和北京中杉公司。采用免疫组织化学法将79例非小细胞肺癌标本均进行Annexin Ⅰ（1∶150）免疫组织化学染色。染色方法严格按说明书进行。用磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline，PBS）代替一抗作为阴性对照，AnnexinⅠ阳性切片作为阳性的对照。
1.3 结果判定
Annexin Ⅰ的阳性染色均以肿瘤细胞膜出现棕黄色颗粒时为阳性表达，以染色强度和阳性的细胞数比例来评定阳性表达。结果判定在双盲方法下进行，每张切片在光镜下随机的被选取5个视野，每个视野计数瘤细胞100个，染色强度分为：无色（－）为0分，浅黄色（+）为1分，黄色或更深颜色（++）为2分。阳性细胞数分级：≤50%为0分，51~75%为1分， ＞ 75%为2分。上面两项得分乘积结果≥2分则为阳性病例。
1.4 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，计数资料采用χ2检验，生存分析采用Kaplan-Meier法。以P ＜ 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
在79例非小细胞肺癌组织中，有40例为Annexin Ⅰ高表达（50.6%），其中鳞癌为包膜表达，腺癌为包膜或胞浆均有表达，以包膜表达为主。见图2、3。非小细胞肺癌组织中Annexin Ⅰ的表达情况与肺癌患者淋巴结受侵相关（P = 0.022，P ＜ 0.05），而与患者的性别、年龄、病理类型及分期之间的关系不明显（P ＞ 0.05）。见表1。淋巴结受侵组的Annexin Ⅰ的阳性表达组的平均疾病进展时间为5.1个月，Annexin Ⅰ阴性表达组的平均疾病进展时间为6.3个月，组间比较差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。见图1。其中47例病例可评价明确的疾病进展时间，在这些病例中，Annexin Ⅰ的阳性表达患者与阴性表达患者的疾病进展时间的关系有统计学意义（P < 0.05），提示Annexin Ⅰ参与到肿瘤恶化的生物学进展中。
3 讨论
Annexin Ⅰ属于钙离子的磷脂依赖蛋白超家族成员，基因定位于人类染色体9q11~9q12上，其长度至少有19 kbp，内含有13个外显子，分子量35~40 KD，每个外显子长度不等，从57~123 kb，被113 bp~55 kbp内含子隔断，此蛋白是表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶的磷酸化的底物，在细胞的生长、分化、细胞内信号传导等方面有着重要的调节作用，可能与Annexin Ⅰ所介导的多种生物学的特征有关[3-4]。有研究检测了Annexin Ⅰ在胃癌原发灶和转移灶的表达，结果发现Annexin Ⅰ在淋巴结转移灶中的表达高于原发灶，尤其在Ⅳ期淋巴结转移灶中的阳性表达高达48%，高达提示了Annexin Ⅰ与肿瘤的远处转移相关[5]。有研究Annexin Ⅰ在正常乳腺导管上皮不表达，在乳腺良性肿瘤中的表达率很低，而在各种组织学类型不同的乳腺癌中却表现出很高的表达率，同时在转移性乳腺癌病例中的表达率明显高于乳腺癌无转移的病例，表明Annexin Ⅰ与乳腺癌的发生及转移有着密切的关系[6]。也有研究显示，在大肠癌转移组中Annexin Ⅰ蛋白的表达较无转移组的高，表达有显著的差异，提示大肠癌的临床分期越高，则Annexin Ⅰ的蛋白表达率越高，Annexin Ⅰ的表达和大肠癌的转移呈正相关[7]。
本实验发现Annexin Ⅰ在肺鳞癌中的表达，阳性率53.8%，在肺腺癌中也呈现表达，阳性率47.5%，且发现Annexin Ⅰ在有淋巴结受侵的组织中的阳性表达，提示了Annexin Ⅰ与淋巴结的转移及肿瘤的远处转移关系密切。对Annexin Ⅰ的表达与肺癌患者的临床病理特征之间的关系进行了统计学分析后显示，Annexin Ⅰ的表达与患者的年龄，性别，组织学类型及组织分期无显著相关性，而与肺癌的淋巴结转移情况有关。有淋巴结转移组的Annexin Ⅰ中的表达高于无转移组的。笔者的研究结果显示，Annexin Ⅰ可能对非小细胞肺癌的淋巴结转移起到一定的促进作用。可能与肺癌的发生、发展及转移相关，Annexin Ⅰ同时参与到肿瘤恶化的生物学进展中，有望成为肺癌早期诊治的理论依据。表皮生长因子受体（EGFR）在所有的表皮细胞以及基质中表达。这里指出附加的调节器或骨架膜组织和膜流量调节的分布的表皮生长因子受体在细胞膜，它包括膜联蛋白，钙依赖性膜结合蛋白家族，与脂质筏形成，有可能影响表皮生长因子受体定位[8]。膜联蛋白是另一类高度保守的钙调节蛋白。虽然结构明确，但其确切的功能尚不完全清楚，但在最近几年已取得科相当大的进展。一些的膜联蛋白发现在细胞膜，特别是Annexin 1，Annexin 2，Annexin 6和Annexin 8似乎参与了EGFR受体信号的调节[8]。一些研究显示，Annexin Ⅰ在生长抑制中的作用，而其他研究表明Annexin Ⅰ的恶性转化与Annexin Ⅰ的表达水平有关[9]。然而Annexin Ⅰ是否影响EGFR受体的转运和在体内的信号目前还不清楚，但 Annexin Ⅰ的调节表皮生长因子受体的功能已经在肝再生及肿瘤中被显示[10]。最近有研究发现，对丝裂霉素、聚乙二醇脂质体盐酸多柔比星、阿霉素及长春新碱的乳腺癌细胞系已检测到Annexin Ⅰ的表达显著升高[11]。通过蛋白质组学研究结果发现，对多种药物耐受的白血病细胞系K562中出现了Annexin Ⅰ表达显著升高[12]。而Annexin Ⅰ在肺癌细胞系中表达及与耐药之间的关系还有待进一步的研究和探讨。
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（收稿日期：2012-03-30 本文编辑：郝明明）