建立鲎试剂法检测双黄连粉针剂中细菌内毒素的方法

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【摘 要】建立鲎试剂法检测双黄连粉针剂细菌内毒素的方法，以适应双黄连粉针剂生产过程中快速检验的需要。方法：中国药典2010版二部细菌内毒素检查法。结果：双黄连粉针剂对鲎试剂与内毒素反应无干扰作用。结论：本法简便、快速，可用于双黄连粉针剂中细菌内毒素的检测。

【关键词】双黄连粉针剂；鲎试剂法；细菌内毒素；干扰试验

双黄连粉针剂具有清热解毒，消炎等功效，临床上广泛用于上呼吸道感染、急性支气管炎、肺炎的治疗。目前本品中细菌内毒素检查法为热源检查，但是热原法（即家兔法）生物差异性大，灵敏度低，所需经验时间较长。鲎试剂法是国际上至今为止检测内毒素最好的方法，具有灵敏度高、操作简单、快速等优点，现将鲎试剂法代替热原法。

1.实验材料

1.1电子天平（BS224S）；对开门净化干热灭菌柜（DMH―0.64m3）；恒温培养箱（HH.B11.360）；温度计（HD2101.1）；旋涡混合器（XW-80A）。

1.2细菌内毒素工作标准品（CSE福州新北生化工业有限公司100910）；检查用水（BET，厦门市鲎试剂实验厂有限公司090803）；鲎试剂1（TAL1福州新北生化工业有限公司0.25EU/ml（100802）、0.125EU/ml（100605）、0.06EU/ml（100711））；鲎试剂2（TAL2湛江安度斯生物有限公司0.25EU/ml（100613）、0.125EU/ml（101201）、0.06EU/ml（100801））。

1.3所需玻璃器皿按规定除热原。

1.4供试品。双黄连粉针剂（哈药集团中药二厂，400mg/支，批号为0910211、1001214、1101210，样品均按质量标准进行热原检查，结果均符合规定）；双黄连粉针剂药液（哈药集团中药二厂，批号为110807、110808、110809，样品均按质量标准进行热原检查，结果均不符合规定）

2.实验方法与结果

2.1鲎试剂灵敏度（λ）复核

依据中国药典2010版二部细菌内毒素检查法检查，均符合规定。

2.2供试品内毒素限值（即L值）的确定[1]

供试品的细菌内毒素阈值（K）为5.0EU/（kg・h），人用每公斤体重每小时最大注射量（M）为1ml/（kg・h），则L=K/M=5.0/1=5.0EU/ml。以此为依据来确定供试品最大有效稀释倍数。

2.3供试品的最大有效稀释倍数（MVD）的确定

MVD=L/λ0.03=5.0/0.03=167倍（λ0.03即0.03EU/ml，为现今我国市售鲎试剂最高灵敏度）。

2.4干扰实验预实验[2]

预实验是对供试品的一系列稀释液进行实验，验证在多大稀释倍数下供试品对鲎试剂与内毒素的反应无干扰，所以首先要确定供试品系列稀释倍数。目前市售鲎试剂灵敏度通常为0.5～0.03EU/ml，于是用BET将供试品稀释至如下倍数：10倍（D0.5）、20倍（D0.25）、40倍（D0.125）、80倍（D0.06）、160倍（D0.03）。其中最大稀释倍数不得超过MVD（即167倍），作为A系列；同时每一稀释浓度下均制备含有2浓度CSE的双黄连粉针剂溶液为B系列。用两个厂家的TAL（0.25EU/ml），分别与A和B系列反应并设阳性对照管及阴性对照管，结果见表1。

根据干扰试验预试验结果可初步判断：双黄连粉针剂的最小不干扰稀释倍数为80倍，且用不同厂家的鲎试剂对三批样品检测结果一致。

2.5干扰实验

干扰试验预试验结果表明，双黄连粉针剂稀释80倍后对鲎试剂与内毒素反应都不存在干扰作用，于是选择最小不干扰稀释倍数――80倍作为供试品的稀释倍数进行干扰实验。先用BET将三批供试品稀释成1：80稀释液做为供试品溶液，即A系列。用BET和三批供试品的稀释液将CSE制成0.5，0.25，0.125，0.0625EU/ml的溶液做为干扰实验系列，即B系列。再用BET将CSE制成0.5，0.25，0.125，0.0625EU/ml的溶液做为TAL标示灵敏度的对照系列，即C系列。再用BET做阴性对照液，即D系列。实验结果见表2。结果表明ES和Et均在0.5λ（ES）～2λ（ES）范围内，说明供试品进行80倍稀释后可以排除干扰作用，在低于或等于此浓度下即可使用鲎试剂法。

2.6细菌内毒素检查

取三批供试品进行80倍稀释，TAL选用2批0.125EU/ml进行实验，实验溶液的制备同预实验，结果均符合中国药典对其有效性的规定。

2.7对比实验

又选取了三批经家兔法检验内毒素超标的供试品进行实验，验证超标供试品是否对实验有干扰，实验方法同2.6。三批供试品的检验结果均为阳性，两种检验方法一致，说明内毒素超标的供试品对本实验无干扰作用。

3、讨论

通过本实验确定了双黄连粉针剂进行80倍稀释后可以排除对TAL的干扰作用，双黄连粉针剂在等于或低于此浓度下即可使用鲎试剂法。

不同厂家的鲎试剂对供试品的抗干扰能力不尽相同，本实验选用两个厂家的鲎试剂，均无干扰。

又选取了三批内毒素超标的供试品进行对比实验，结果超标供试品对实验无干扰。

本法比家兔法简便、快速，可用于双黄连粉针剂中细菌内毒素的检测。