微小核糖核酸—21反义寡核苷酸对人舌鳞癌细胞生长抑制的体内研究

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[摘要] 目的 研究微小核糖核酸-21（miR-21）反义寡核苷酸（AS-miR-21）对人舌鳞癌生长的抑制作用。方法 采用稳定转染pGL6荧光素酶报告基因质粒的舌鳞癌细胞Tca8113-luc接种裸鼠，建立移植瘤动物模型，瘤体内注射AS-miR-21，应用活体成像和TUNEL等实验技术进行AS-miR-21对人舌鳞癌细胞系生长抑制的体内研究。结果 通过转染pGL6荧光素酶报告基因质粒构建了稳定表达荧光素酶活性的Tca8113-luc细胞株。裸鼠皮下荷瘤模型成瘤率高，肿瘤生长稳定。在瘤体内注射AS-miR-21后肿瘤生长减慢，活体成像中光子数偏低，肿瘤标本中坏死灶少见，细胞核变小，染色变浅，异型性减低，新生血管数减少。肿瘤组织中miR-21表达明显下降，凋亡指数升高。结论 肿瘤内注射AS-miR-21可以降低舌鳞癌细胞中miR-21的表达，促进舌鳞癌肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤的生长。

[关键词] 舌鳞癌； 微小核糖核酸-21； 微小核糖核酸-21反义寡核苷酸； 基因治疗； 活体成像

[中图分类号] R 739.86 [文献标志码] A [doi] 10.3969/j.issn.1000-1182.2012.06.002

靶向微小核糖核酸-21（micro ribonucleic acid-

21，miR-21）的反义寡核苷酸可以有效抑制舌鳞癌细胞的增殖，促进细胞凋亡，抑制细胞的迁移和侵袭能力。笔者采用稳定转染pGL6荧光素酶报告基因

质粒的舌鳞癌细胞Tca8113-luc接种裸鼠，建立舌鳞癌移植瘤动物模型，利用脂质体OligofectamineTM为载体，瘤体内注射miR-21反义寡核苷酸（antisense-

miR-21 oligonucleotide，AS-miR-21），应用活体成像和TUNEL等实验技术进一步进行AS-miR-21对人舌鳞状细胞癌细胞系生长抑制的体内研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 人舌鳞癌细胞系Tca8113由上海交通大学口腔肿瘤生物实验室建立并提供。

1.1.2 siRNA oligo 根据microRNA数据库（http：//www.sanger.ac.uk）提供的基因序列，获取人miR-21的序列，依序列互补原理设计相应的反义寡核苷酸序列和随机对照序列，并采用BLAST软件分析，人工合成的寡核苷酸序列以2’O-Me修饰。AS-miR-21序列：5’-GUCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3’；Scrambled序列：5’-AAGGCAAGCUGACCCUGAAGU-3’。

1.1.3 质粒 pGL6荧光素酶报告基因质粒购自江苏碧云天生物技术公司，含有荧光素酶编码luc基因和G418抗性的Neo基因。

1.1.4 实验动物 BALB/c-nu（SPF）雌性裸小鼠，4～6周龄，体重15～18 g，共24只，购自北京大学医学部实验动物科学部。

1.1.5 主要试剂和仪器 LipofectamineTM及Oligofec-tamineTM Reagent（Invitrogen公司，美国），TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（南京凯基生物公司），精诺真活体动物体内可见光成像系统IVIS200及气体麻醉系统XGI-8（Xenogen公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞处理方法 将Tca8113细胞常规复苏、传代，于37 ℃、5%CO2孵箱中培养，选用对数生长期、0.2%台盼蓝拒染率>95%的细胞。

1.2.2 质粒扩增提纯及质粒酶切、转染 按德国Qia-gen公司大量质粒扩增纯化试剂盒要求扩增提纯pGL6荧光素酶报告基因质粒后，以Hind Ⅲ酶切并再次提纯，利用LipofectamineTM将其稳定转染Tca8113细胞。

1.2.3 细胞筛选及稳定表达荧光素酶基因细胞克隆的培养和鉴定 以G418筛选稳定表达荧光素酶基因的Tca8113-luc细胞，培养细胞克隆。倍比稀释细胞克隆，采用可见光成像系统成像，检测Tca8113-luc细胞荧光素酶基因表达效率，分析荧光强度与细胞数之间的相关性，绘制Tca8113-luc细胞生长曲线。

1.2.4 人舌鳞癌Tca8113-luc裸鼠模型的建立 将24只裸鼠随机分为空白对照（control）组、无义序列（Scr-miR）组和反义序列（AS-miR-21）组，每组8只。取对数生长期的Tca8113-luc细胞，调整细胞浓度至每毫升1×107个，每只200 μL接种于裸鼠右侧鼠蹊部皮下。

1.2.5 裸鼠荷瘤生长及治疗情况 接种肿瘤细胞第15天，23只裸鼠成瘤，成瘤率为95.83%，肿瘤大小为（0.109±0.076） cm3，最小肿瘤为0.2 cm×0.2 cm时开

始治疗。将20 pmol·μL-1的AS-miR-21及Scrambled寡核苷酸各150 μL分别与60 μL OligofectamineTM Rea-gent混匀后，以无菌微量注射器肿瘤内多点缓慢注射，每只裸鼠每次注射混合物25 μL。每4 d治疗1次，至观察期结束（4周）。自裸鼠开始治疗之日起，每次

治疗前用游标卡尺测量肿瘤长径（a）及宽径（b），肿瘤体积计算公式为：V=（ab2）/2；观察肿瘤界限，浸润情况，有无坏死、破溃、感染及裸鼠全身状况。

1.2.6 活体成像 裸鼠接种Tca8113-luc细胞当日及之后每7 d行活体成像1次。电子天平称重后腹腔注射荧光素酶底物150 mg·kg-1体重（含量为15 mg·mL-1），以气体麻醉系统XGI-8麻醉，待底物作用10 min后，将裸鼠按顺序放入暗箱，平卧位，曝光成像。屏蔽原位瘤，可成像观察有无淋巴结及远处转移。应用成像系统软件完成图像分析过程。

1.2.7 裸鼠肿瘤组织实时荧光定量聚合酶链反应（po-lymerase chain reaction，PCR）、苏木精-伊红（hema-

toxylin-eosin，HE）及TUNEL检测 治疗后第28天断颈处死所有裸鼠，解剖原位肿瘤，提取RNA后行实时荧光定量PCR检测miR-21表达；原位肿瘤及肿大淋巴结常规石蜡包埋切片，HE染色行肿瘤组织病理检查；石蜡切片FITC标记POD法进行TUNEL实验，检测细胞凋亡，阳性结果判断标准：紫外光下所有细胞核均被染成蓝色，在495 nm激发波长下可在荧光显微镜下看到凋亡细胞细胞核的绿色荧光。每张切片随机选取8个视野（400×），每个视野至少计数100个细胞，计算细胞凋亡指数，以百分比表示。

1.3 统计学分析

采用SPSS 10.0统计软件包对所有数据进行统计分析，实时荧光定量PCR采用ANOVA单因素方差分析；计量资料（或经转换后变为计量资料）多组间均数的比较采用单因素方差分析；光子数和细胞数的关系分析采取二元变量的相关分析，P

2 结果

2.1 Tca8113细胞G418最佳筛选浓度

Tca8113细胞G418最佳筛选浓度为400 μg·mL-1。筛选稳定表达荧光素酶基因的Tca8113-luc细胞时所用浓度为基准浓度高一级，即600 μg·mL-1，维持浓度为筛选浓度的半量，即300 μg·mL-1。

2.2 Tca8113-luc细胞荧光素酶活性检测

Tca8113-luc细胞经过G418筛选后，得到稳定表达荧光素酶基因的细胞克隆，倍比稀释，最低检测到78个细胞的荧光素酶活性。细胞数和光子数的线性关系见图1。光子数与细胞数相关系数R为1，表明二者相关性极强，提示Tca8113-luc细胞能稳定表达荧光素酶基因，有较强的荧光素酶活性。

2.3 Tca8113-luc细胞系生长曲线

Tca8113和Tca8113-luc细胞在较长生长周期内基本一致，表明Tca8113-luc细胞构建过程没有对细胞生长特性产生影响（图2）。

2.4 荷瘤裸鼠治疗中肿瘤变化情况

肿瘤体积变化曲线中，空白对照组和Scr-miR组肿瘤生长速度较快，且成瘤后从第9天开始明显加快，2组肿瘤体积差异无统计学意义。AS-miR-21组肿瘤生长速度慢，肿瘤体积较小，但治疗21 d前3组间差异无统计学意义（P>0.05）。从第21天起，AS-

miR-21组肿瘤体积与另外2组肿瘤生长出现明显差异（P

所有裸鼠肿瘤全部界限清楚，无明显浸润，未见转移灶。空白对照组和Scr-miR组较大的肿瘤有明显出血、液化和坏死，局部表面有溃破；荷瘤较大的裸鼠全身状况较差，体重减轻。而AS-miR-21组肿瘤个体较小，均为实体性，无明显液化、坏死灶。AS-miR-21组裸鼠瘤体内注射AS-miR-21后能减缓肿瘤生长（肿瘤没有减小但生长速度变慢，生长趋势

减缓）（图4）。

2.5 活体成像

每只裸鼠接种部位均有荧光成像，且光子数比较均一，提示接种于裸鼠的Tca8113-luc细胞能稳定表达荧光素酶活性（图5）。

实验第1周裸鼠接种肿瘤细胞至第3周裸鼠成瘤，活体成像光子数无差异（图6、7）。经AS-miR-21治

疗2周后，光子数出现差异，AS-miR-21组数值明显低于其他2组，表明AS-miR-21有效抑制了肿瘤的生长。而在治疗第3周之后，空白对照组和Scr-miR组的光子数有所下降，使3组间的差别消失。活体成像显示各组裸鼠肿瘤均未见远处和淋巴结转移。

2.6 HE染色检测肿瘤组织病理学改变

裸鼠肿瘤病理形态观察结果见图8。空白对照组及Scr-miR组肿瘤细胞生长旺盛，形态不规则，细胞核大，染色深，核分裂相多见，异型性明显，瘤巨细胞较多，新生血管数也较多，肿瘤内出现大面积坏死。而AS-miR-21组肿瘤坏死灶少见，细胞核小，染色变浅，异型性减低，新生血管数减少。所有肿瘤组织可见少量炎性细胞浸润。切取的肿大淋巴结均为正常淋巴结组织，未见转移癌。

2.7 裸鼠肿瘤组织中miR-21的表达

实时荧光定量PCR产物电泳结果见图9。AS-

miR-21组miR-21表达比空白对照组和Scr-miR组明显减低。裸鼠经AS-miR-21治疗后，肿瘤组织中的miR-21表达下降，分别是空白对照组及Scr-miR组的36%和29.5%，二者间差异有统计学意义（P

2.8 TUNEL原位凋亡检测

紫外光下所有细胞核均被染成蓝色，凋亡细胞在495 nm激发波长下可在荧光显微镜下观察到细胞核的绿色荧光（图10）。AS-miR-21治疗后凋亡细胞

数明显增多，凋亡指数为37%，与空白对照组和Scr-miR组比较差异有统计学意义（P

注射AS-miR-21能有效促进舌鳞癌肿瘤细胞凋亡。

3 讨论

miRNA在细胞的增殖、分化等方面发挥着重要的调节作用，是肿瘤发生发展过程中基因表达的有力调节者。以miRNA为靶点设计的基因药物为研究肿瘤的发生、发展及基因治疗提供了新的手段和途径。当miRNA在肿瘤中低表达或作为肿瘤抑癌基因时，可以采用miRNA的替代疗法，在肿瘤组织中用病毒或脂质体等系统转染模拟内源性miRNA的人工合成的miRNA，使其过量表达，以达到靶向抑制肿瘤、诱导调亡的作用[1]。而当miRNA在肿瘤中高表达

或作为癌基因时，导入与miRNA互补的反义寡聚核苷酸序列，与miRNA结合形成杂化双链，激活RNA酶H，进而降解并抑制miRNA活性，干扰其表达水平，被认为是目前最好的方法[2]。

此前的体外实验研究证实口腔鳞癌中存在miR-21高表达。它发挥着原癌基因的作用，通过反向调节肿瘤抑制基因和/或控制细胞分化或凋亡的基因而促进肿瘤的形成[3]，在肿瘤的发生发展中发挥着重要

作用。miR-21与肿瘤细胞增殖、抗凋亡及侵袭性相关的功能，以及其对多种促凋亡抗侵袭的肿瘤抑制基因的直接调控，使其序列特异性的抑制物能对癌症中表达失调的多种蛋白进行生理性调控，为癌症提供一个新的治疗途径[4-7]。

笔者采用稳定转染pGL6荧光素酶报告基因质粒的Tca8113-luc细胞接种裸鼠，建立移植瘤动物模型，通过瘤体内给药，进行AS-miR-21对人舌鳞状细胞癌细胞系生长抑制的体内研究。通过对裸鼠进行为期28 d的治疗和观察，AS-miR-21组肿瘤生长速度慢，肿瘤体积较小，肿瘤标本中坏死灶少见，细胞核变小，染色变浅，异型性减低，新生血管数减少。经实时荧光定量PCR检测表明裸鼠经AS-miR-21治疗后，肿瘤细胞中miR-21表达明显下降，TUNEL检测显示AS-miR-21组凋亡指数升高，提示以Oligofec-tamineTM为载体行AS-miR-21瘤体内注射可有效降低肿瘤细胞中miR-21的表达，有效促进舌鳞癌肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长，提示了AS-miR-21作为人口腔鳞癌治疗靶标的可能性。

活体生物体内成像技术已经广泛应用于生命科学、医学研究及药物开发等方面[8-9]。本研究利用脂质体转染法，将酶切后的pGL6荧光素酶报告基因质粒转入Tca8113细胞中。应用G418（最佳筛选终浓度为400 μg·mL-1）筛选出稳定表达荧光素酶活性的

Tca8113-luc细胞系。将Tca8113-luc细胞接种于裸鼠，建立舌癌的动物模型，以进行活体成像实验。观测前需注射荧光素酶底物—荧光素。美国Xeno-gen公司生产的IVIS成像系统，在动物体内可监测到102个细胞[10-12]。笔者构建的Tca8113-luc细胞株在接种于裸鼠当时及接种后2周成瘤时均有荧光素酶表达且接种肿瘤细胞和成瘤时各组活体成像光子数测定无差别。随着肿瘤的增长，空白对照组和Scr-miR组荧光值快速增加，在成瘤治疗后2周就已达到饱和，到第3周时，肿瘤中心已出现坏死，中心荧光值降低。而AS-miR-21组的荧光值增加则比较缓慢，从治疗后2周就与其他两组有显著性差异。但到第3周以后，空白对照组和Scr-miR组由于部分肿瘤体积较大，发生液化坏死，使荧光值降低，各组之间无差异。实验观察期为4周，可明显看到对照组和实验组的肿瘤生长体积的差别。但后期各组活体成像的荧光信号差异却与各组肿瘤大小差异产生矛盾，考虑可能是空白对照组和Scr-miR组肿瘤组织产生了大量坏死，使活体成像信号减弱的原因。但如果缩短观察时间又无法足够且正确地评价AS-miR-21对肿瘤的抑制作用。这个问题还有待于进一步探索解决。应用活体成像监测Tca8113-luc肿瘤体内生长情况，治疗前后各组均未发现肿瘤有淋巴结和远处转移，这可能和肿瘤细胞的接种方式有关。应用的是鼠蹊部皮下成瘤的方法，如果采用细胞尾静脉注射裸鼠成瘤，得到肿瘤转移模型的可能性会增加，将使AS-miR-21对肿瘤生长、转移的抑制作用得到更有说服力的体现。

随着人类基因组计划的完成、细胞分子生物学技术的发展和其他肿瘤治疗手段的日益完善，基因治疗可望成为肿瘤治疗的又一常规手段。通过细胞特异性病毒或脂质体，把靶标miR-21抑制剂传送至疾病的（如肿瘤）细胞中，可以作为miR-21抑制作用的一项有效途径。无论如何，miR-21与人类多种疾病的密切相关及其在许多关键癌基因中的调控作用使这个小分子成为日后研究和基因治疗的一个重要的靶标。

[参考文献]

[1] Dahan M， Lévi S， Luccardini C， et al. Diffusion dynamics of gly-

cine receptors revealed by single-quantum dot tracking[J]. Science，

2003， 302（5644）：442-445.

[2] Krützfeldt J， Rajewsky N， Braich R， et al. Silencing of microRNAs

in vivo with antagomirs’[J]. Nature， 2005， 438（7068）：685-689.

[3] Zhang Z， Li Z， Gao C， et al. miR-21 plays a pivotal role in gas-

tric cancer pathogenesis and progression[J]. Lab Invest， 2008， 88

（12）：1358-1366.

[4] Si ML， Zhu S， Wu H， et al. miR-21-mediated tumor growth[J].

Oncogene， 2007， 26（19）：2799-2803.

[5] Gabriely G， Wurdinger T， Kesari S， et al. MicroRNA 21 promotes

glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators[J].

Mol Cell Biol， 2008， 28（17）：5369-5380.

[6] Connolly E， Melegari M， Landgraf P， et al. Elevated expression

of the miR-17-92 polycistron and miR-21 in hepadnavirus-asso-

ciated hepatocellular carcinoma contributes to the malignant phe-

notype[J]. Am J Pathol， 2008， 173（3）：856-864.

[7] Ji R， Cheng Y， Yue J， et al. MicroRNA expression signature and

antisense-mediated depletion reveal an essential role of MicroRNA

in vascular neointimal lesion formation[J]. Circ Res， 2007， 100（11）：

1579-1588.

[8] Ntziachristos V， Ripoll J， Wang LV， et al. Looking and listening

to light： The evolution of whole-body photonic imaging[J]. Nat Bio-

technol， 2005， 23（3）：313-320.

[9] Maggi A， Ciana P. Reporter mice and drug discovery and deve-

lopment[J]. Nat Rev Drug Discov， 2005， 4（3）：249-255.

[10] Edinger M， Cao YA， Verneris MR， et al. Revealing lymphoma

growth and the efficacy of immune cell therapies using in vivo

bioluminescence imaging[J]. Blood， 2003， 101（2）：640-648.

[11] Troy T， Jekic-McMullen D， Sambucetti L， et al. Quantitative com-

parison of the sensitivity of detection of fluorescent and biolumi-

nescent reporters in animal models[J]. Mol Imaging， 2004， 3（1）：

9-23.

[12] Minn AJ， Gupta GP， Siegel PM， et al. Genes that mediate breast

cancer metastasis to lung[J]. Nature， 2005， 436（7050）：518-524.