骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤
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【摘 要】脊髓损伤（spinal cord injury， SCI）是一种临床上常见的以损伤平面以下感觉、运动功能完全丧失和大小便失禁为主要表现的中枢神经系统的严重创伤。由于神经元本身再生能力不足及损伤局部缺乏适宜的再生微环境，脊髓损伤的治疗成为医学界研究的难题。近年来，随着神经生物学和干细胞技术的发展，干细胞移植成为治疗脊髓损伤的新希望和新方法。目前可供选择的移植细胞类型有胚胎干细胞、神经干细胞、嗅鞘细胞、雪旺细胞、骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）和成纤维细胞等，而骨髓间充质干细胞以其强大的增殖和分化能力，取材方便，易于分离培养和低免疫源性等特征而被广泛用于疾病研究及治疗，因此探索BMSCs移植治疗SCI具有重要的临床意义。本实验旨在研究BMSCs的不同移植方式对于SCI治疗效果的比较，为临床BMSCs移植治疗SCI寻找一种更有效的移植方式。
【中图分类号】R459 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）03-0039-04
材料和方法
1.大鼠BMSCs的培养
健康雄性Wistar大鼠，SPF级，年龄30天左右，由湖北省实验动物研究中心提供，合格证号：SCXK（鄂）2008-0005。
全骨髓贴壁法：取一月龄Wistar大鼠，断颈处死；严格无菌条件下取大鼠的
双侧后肢的股骨和胫骨，去除骨表面的肌肉组织，Hanks液清洗，剪去骨骺端，暴露骨髓腔；用5ml的无菌注射器吸取Hanks液冲洗骨髓腔，收集冲出的骨髓细胞，反复吹打制成单细胞悬液；而后接种在T25的培养瓶内，置于37℃ 、5%CO2培养箱内孵育。首次换液时间为第3天，以后每3天更换培养液一次。待细胞融合达到70%开始传代。
BrdU标记
取实验中培养的第4代BMSCs用于移植，移植前24h更新培养基，加入BrdU，终浓度为10?mol/l，移植前将细胞制成PBS悬液，并调整细胞浓度为3×104/?l。
2.大鼠脊髓损伤模型的建立[1-3]
健康雄性Wistar大鼠，SPF级，体重250g-300g，由湖北省实验动物研究中心提供，合格证号：SCXK（鄂）2008-0005。
大鼠经适应性喂养两天后开始造模，造模前禁食12h，腹腔注射戊巴比妥钠（45-50mg/kg），备皮消毒，铺无菌洞巾，寻找胸椎T9-11，沿正中切开皮肤，经钝性分离筋膜与肌肉，暴露脊椎，打开椎板，暴露脊髓，脊髓右侧半横断损伤，肌肉筋膜皮肤分层缝合，消毒贴创可贴，青霉素肌肉注射50万单位/次。术后护理：术后前三天每天三次膀胱按摩，术后一周每三天肌肉注射青霉素一次。每周BBB （basso beattie and bresnahan，BBB）评分一次。
实验分组与项目观察
将32只Wistar大鼠随机分为四组：（A）尾静脉注射PBS（ipbs），8只；（B） 脊髓局部靶点注射PBS（lpbs），8只；（C）尾静脉注射BMSCs细胞悬液（ibmsc），8只；（D） 脊髓局部靶点注射BMSCs细胞悬液（lbmsc），8只。
观察项目：每周进行一次BBB评分，于细胞移植后第4W、8W 取材观察脊髓损伤修复的情况。
3.BMSCs移植
实验组在脊髓损伤1周后，分别进行尾静脉注射和脊髓局部靶点注射，尾静脉注射组：1ml注射器从尾静脉注射，注射后留针30s～60s；局部靶点注射组：10?l微量注射器在距损伤区大约0.5cm的上下四个点注射10?l细胞悬液（第4代BMSCs，密度均为3×104/?l），进针深度1.5mm～1.6mm；对照组：以同样的方法注射等量的PBS，注射后留针30s～60s。
4.行为学评估
所有大鼠在术后1w，2w，3w，4w，5w，6w，7w和8w进行BBB评分，完全瘫痪 0，正常为21。评分采用双人双盲法，即参与评分的两个人不参与实验，但对该实验又有所了解，而且各自评分最后取其平均值。所有评分均在晚上进行。
5.脊髓组织的灌流固定
在脊髓损伤后随机取各组大鼠在不同时间（2w、4w、8w）的组织标本，用戊巴比妥钠（40-50mg/kg）腹腔注射，待麻醉起效后，剪开皮肤、皮下、肌肉、肋骨，开胸；暴露心脏，可见左右心室、左右心房及心脏搏动，用眼科小平镊提起心脏，用小剪刀剪破左心尖，插入小塑料管入升主动脉，塑料管末端连接注射器，用止血钳轻轻夹住固定，先快速推注浓度为10万单位/100ml的肝素钠40ml，然后用80ml PBS冲洗，待右心房流出的冲洗液清亮后，用4%多聚甲醛150ml心内灌注，灌注时可见四肢及躯体的肌肉抽动，右心房流出的冲洗液具有氨味，灌注固定30min；剪开原背部切口皮肤，剔除骶棘肌，以损伤区域为中心，用咬骨钳咬去上下节段的椎板、关节突，暴露损伤段及邻近节段的脊髓，取长约4的脊髓段，在4℃冰箱中用4%多聚甲醛固定12h；常规脱水，石蜡包埋，连续切片，片厚5?m，HE苏木素染色；在光学显微镜下观察。