外源性S100a8和S100a9与结肠癌侵袭转移的关系研究
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇外源性S100a8和S100a9与结肠癌侵袭转移的关系研究范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
摘要：目的 研究外源性s100a8和s100a9与结直肠癌侵袭转移的关系。方法 Real-time PCR检测巨噬细胞RAW264.7及结肠癌细胞CT26.WT中S100a8和S100a9的基因表达水平；ELISA检测RAW264.7及CT26.WT细胞分泌至胞外的S100a8和S100a9的蛋白含量。划痕实验和Transwell实验检测外源性S100a8和S100a9蛋白对结肠癌细胞侵袭转移的影响。结果 S100a8和S100a9在巨噬细胞中的表达明显高于结肠癌细胞（P=0.0126；P=0.03）；外源性S100a8和S100a9均能促进结肠癌细胞发生侵袭和转移（P=0.0128；P=0.0011）。结论 结肠癌肿瘤微环境中S100a8和S100a9主要在巨噬细胞中高表达和分泌，并发挥促结肠癌侵袭转移的作用，有可能成为治疗结肠癌进展的新靶点。
关键词：结直肠肿瘤；S100a8和S100a9；侵袭转移
结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是消化道最常见的恶性肿瘤之一，其全球发病率呈逐年上升趋势。我国结直肠癌发病率已跃居恶性肿瘤发病率的第3位，其病死率高达45.5%[1]，而肿瘤发生侵袭转移被认为是肿瘤致死的重要因素。研究表明S100a8和S100a9在乳腺癌、结直肠癌等多种肿瘤中高表达，且外源性的S100a8和S100a9与转移前生态位的形成密切相关，促进肿瘤细胞的在转移部位的定植[2-5]。本实验着重阐述S100a8和S100a9在肿瘤微环境中的来源，并检测外源性S100a8和S100a9对结直肠癌侵袭转移的影响。
1 资料与方法
1.1主要细胞和试剂 小鼠结肠癌细胞CT26.WT和小鼠巨噬细胞RAW264.7均购自ATCC。主要试剂：引物和RNA抽提试剂盒Trizol（Invitrogen）；逆转录试剂盒（Fermentas）；荧光染料 SYBR Green Master Mix （Takara）；S100a8和S100a9 ELISA检测试剂盒（USCNK Life Science）；小鼠S100a8和S100a9重组蛋白（Abnova）； Transwell 小室（Corning）；基质胶（BD Biosciences）；MTT（Sigma）。
1.2方法 Primer5软件进行引物设计，小鼠S100a8上游引物5'-GACAATGCCGTCTGAACTGG；GCTACTCCTTGTGGCTGTCTT-3'；小鼠S100a9上游引物5'-ACCACCATCATCGACACCTTC；AAAGGTTGCCAACTGTGCTTC-3'；RNA抽提、逆转录、实时荧光定量PCR、Transwell实验、划痕实验均严格按照说明书进行。以上实验至少重复3次。
1.3统计学处理 应用GraphPad Prism 5 统计软件进行统计学分析。计量资料分析采用t检验，P
2 结果
2.1 S100a8和S100a9在巨噬细胞中的表达明显高于结肠癌细胞 Real-time PCR结果显示，巨噬细胞RAW264.7中S100a8和S100a9的基因表达水平明显高于结肠癌细胞CT26.WT，P值分别为0.0126和0.03（图1），差异具有统计学意义。ELISA方法同样表明，巨噬细胞RAW264.7分泌至胞外的S100a8和S100a9蛋白含量明显高于结肠癌细胞CT26.WT，P值分别为0.0128和0.0011（图2），差异具有统计学意义。
图1 Real-time PCR检测巨噬细胞RAW264.7和小鼠结肠癌细胞CT26.WT中S100a8和S100a9的表达
图2 ELISA检测巨噬细胞RAW264.7和小鼠结肠癌细胞CT26.WT分泌的S100a8和S100a9
2.2外源性S100a8和S100a9促进结肠癌细胞侵袭和转移 4ug/ml的S100a8和S100a9蛋白分别刺激小鼠结肠癌细胞CT26.WT，进行划痕实验观测肿瘤细胞迁移能力。如图3所示，外源性S100a8和S100a9蛋白均能促进结肠癌细胞的迁移，诱导伤口愈合。以同等浓度的S100a8和S100a9蛋白分别刺激CT26.WT，transwell实验检测肿瘤细胞的侵袭能力，如图4所示，外源性S100a8和S100a9蛋白均能增强结肠癌细胞的侵袭能力。
图3 划痕实验检测外源性S100a8和S100a9蛋白对CT26.WT迁移能力的影响
图4 Transwell实验检测外源性S100a8和S100a9蛋白对CT26.WT侵袭能力的影响
3 讨论
结直肠癌是常见的恶性肿瘤，世界范围内，每年约有120万新发病例，约有60万人死于结直肠癌[6]。我国结直肠癌年增加率为4.2%，高于全球平均递增速度。结直肠癌的发生及发展是一个复杂的演变过程，其发生侵袭转移是致死的重要原因。研究表明，肿瘤微环境中CXCL1、CCL2等多种细胞因子和趋化因子与肿瘤的侵袭转移密切相关[7-8]。
S100a8和S100a9均属于S100蛋白家族成员，为低分子量钙结合蛋白，二者常以Ca2+ 依赖的方式形成S100a8/a9异源二聚体（又叫钙卫蛋白）发挥生物学效应[9]。S100a8/a9主要在粒细胞、巨噬细胞和骨髓来源抑制细胞（MDSC）中表达，LPS、 TNF -a 、IL1β、 IL-10 、IL-22等炎症因子刺激下S100a8和S100a9表达和分泌增强，且通常与TLR4和RAGE受体结合后激活多种信号通路发挥生物学效应[10-11]。本研究发现，S100a8和S100a9主要在巨噬细胞中表达和分泌，在结肠癌细胞中的表达和分泌相对较少。
研究表明，S100a8/9参与多种肿瘤的侵袭转移，且内源性和外源性S100a8/a9对肿瘤的侵袭转移扮演的角色各不相同，此特性可能依赖于胞外S100a8/a9浓度的变化。研究基本认为在20-250ug/ml浓度范围内促进肿瘤细胞凋亡，小于20ug/ml的浓度促进肿瘤细胞增殖[12-14]。本研究证实，低浓度（4ug/ml）的S100a8和S100a9蛋白均能促进结肠癌细胞的侵袭和转移。
总之，上述结果表明，结肠癌肿瘤微环境中巨噬细胞高表达和分泌S100a8和S100a9从而促进结直肠癌细胞发生侵袭和转移，此研究结果为结直肠癌侵袭转移机制的进一步研究提供了新思路，为结直肠癌侵袭转移的诊断及靶向治疗提供了重要的方向。
参考文献：
[1]Cunningham D， Atkin W， Lenz H J et al. Colorectal cancer[J]. Lancet，2010，375：1030-1047. [2]Lukanidin E， Sleeman J P.Building the niche： the role of the S100 proteins in metastatic growth Semin[J]. Cancer Biol，2012，22：216-225.
[3]Saha A， Lee Y C， Zhang Z，et al. Lack of an endogenous anti-inflammatory protein in mice enhances colonization of B16F10 melanoma cells in the lungs[J]. J Biol Chem，2010，285 ：10822-10831.
[4]Hiratsuka S， Watanabe A， Sakurai Y，et al. The S100A8-serum amyloid A3-TLR4 paracrine cascade establishes a pre-metastatic phase[J]. Nat Cell Biol，2008，10：1349-1355.
[5]Rafii S， Lyden D.S100 chemokines mediate bookmarking of premetastatic niches[J]. Nat Cell Biol，2006，8：1321-1323.
[6]Brenner H， Kloor M， Pox C P.Colorectal cancer[J]. Lancet，2013.
[7]Acharyya S， Oskarsson T， Vanharanta S，et al. A CXCL1 paracrine network links cancer chemoresistance and metastasis[J]. Cell，2012，150：165-178.
[8]Li X， Xu Q， Wu Y，et al. A CCL2/ROS autoregulation loop is critical for cancer-associated fibroblasts-enhanced tumor growth of oral squamous cell carcinoma[J]. Carcinogenesis，2014.
[9]Ghavami S， Chitayat S， Hashemi M，et al. S100A8/A9： a Janus-faced molecule in cancer therapy and tumorgenesis[J]. Eur J Pharmacol，2009，625：73-83.
[10]Gebhardt C， Nemeth J， Angel P，et al. S100A8 and S100A9 in inflammation and cancer[J]. Biochem Pharmacol，2006，72：1622-1631.
[11]Goyette J， Geczy CL.Inflammation-associated S100 proteins： new mechanisms that regulate function[J]. Amino Acids，2011，41：821-842.
[12]Ghavami S， Rashedi I， Dattilo B M，et al. S100A8/A9 at low concentration promotes tumor cell growth via RAGE ligation and MAP kinase-dependent pathway[J]. J Leukoc Biol，2008，83： 1484-1492.
[13]Ghavami S， Chitayat S， Hashemi M，et al. S100A8/A9： a Janus-faced molecule in cancer therapy and tumorgenesis[J]. Eur J Pharmacol，2009，625：73-83.
[14]Turovskaya O， Foell D， Sinha P，et al. RAGE， carboxylated glycans and S100A8/A9 play essential roles in colitis-associated carcinogenesis[J]. Carcinogenesis，2008，29：2035-2043.