枸杞花总黄酮的测定

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摘要：依次以水和体积分数９５％的乙醇为提取剂，采用超声法提取获得宁夏枸杞（Ｌｙｃｉｕｍ ｂａｒｂａｒｕｍ Ｌ．）花的提取物，采用Ａｌ（ＮＯ３）３法测得样品中的总黄酮含量为２．９５ ｍｇ／ｇ。结果表明该方法可快速评价枸杞花中的总黄酮水平。

关键词：枸杞花；黄酮；芦丁；测定

中图分类号：Ｏ６５７．３２ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）06－1240-02

Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Tｏｔａｌ Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ Ｌｙｃｉｕｍ ｂａｒｂａｒｕｍ Ｆｌｏｗｅｒｓ

ＢＥＩ Ｚｈａｎ－ｌｉｎ，ＺＨＡＮＧ Ｘｉｎ，ＣＡＯ Ｊｕｎ－ｍａｉ，ＬＥＩ Ｑｉａｎ，ＬＵ Ｗｅｉ－ｌａｉ

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｂｅｉｆａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ， Ｙｉｎｃｈｕａｎ ７５００２１ Ｎｉｎｇｘｉａ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ Ｌｙｃｉｕｍ ｂａｒｂａｒｕｍ Ｌ． ｆｌｏｗｅｒｓ ｆｒｏｍ Ｎｉｎｇｘｉａ ｗｅｒｅ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ Ｈ２Ｏ ａｎｄ ９５％（Ｖ／Ｖ） ｅｔｈａｎｏｌ， ａｎｄ ｔｈｅｎ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ Ａｌ（ＮＯ３）３ ｍｅｔｈｏｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ content ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ was ２．９５ ｍｇ／ｇ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ ａｎｄ ｆａｓｔ ｆｏｒ ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ Ｌ. ｂａｒｂａｒｕｍ Ｌ． ｆｌｏｗｅｒｓ

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｌｙｃｉｕｍ ｂａｒｂａｒｕｍ Ｌ． ｆｌｏｗｅｒ； ｆｌａｖｏｎｏｉｄ； ｒｕｔｉｎ； determination

枸杞（Ｌｙｃｉｕｍ ｂａｒｂａｒｕｍ Ｌ．）全身是宝，枸杞花通常单生或数朵簇生于叶腋或短枝上，紫色或淡紫色，花梗细，花期４月至１０月［１，２］。黄酮类化合物在植物界分布广泛，对植物生长具有重要作用，同时也具有一定的抗菌防病功效［３］。通常条件下，植物体内的黄酮多以和糖结合形成的苷类存在，少数以游离形式存在，现在则泛指２个苯环通过中央三碳链相互联结（Ｃ６－Ｃ３－Ｃ６）而成的一系列化合物［４，５］。目前，人们对枸杞的药用成分及药用机理等研究较多，但对枸杞花研究较少。已有报道包括枸杞的花联合现象［６］和枸杞花色素提取工艺研究［７］。本研究采用比色法测定枸杞花中总黄酮类化合物的含量，为快速评价枸杞花中的黄酮类化合物水平提供参考。

１ 材料与方法

１．１ 材料与试剂

鲜枸杞花（宁杞１号）于２０１０年８月采自宁夏育新枸杞园，标本保存于北方民族大学生物科学系植物标本室。枸杞花放置阴干后，粉碎并置于密封塑料袋中保藏备用。

芦丁标准品、无水乙醇、ＮａＮＯ２、Ａｌ（ＮＯ３）３、ＮａＯＨ，去离子水。

１．２ 仪器

ＦＷ１００型高速粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）、ＦＡ２１０４Ｂ电子天平（上海精密科学仪器有限公司）、ＫＱ－５００Ｂ超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）、减压蒸馏装置、ＡＬＰＨＡ １－２冷冻干燥机（德国Ｍａｒｉｎ Ｃｈｒｉｓｔ 公司）、Ｓｉｇｍａ ４Ｋ１５离心机（德国Ｓｉｇｍａ公司）、ＵＶ７６５紫外－可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。

１．３ 方法

１．３．１ 样品制备 水提取物的制备：称取干燥处理的枸杞花５．０ ｇ于２５０ ｍＬ锥形瓶中，加入Ｈ２Ｏ １００ ｍＬ，在５０ ℃下超声提取５０ ｍｉｎ，然后将提取液真空抽滤，得澄清提取液，残渣用蒸馏水洗涤后，重复提取２～３次，收集合并抽滤后的提取液，减压蒸馏得浓缩提取液。

乙醇提取物的制备：向上述枸杞花残渣中加入６０％（体积分数，下同）的乙醇，提取方法及步骤与水提取方法相同，然后依次用８５％和９５％的乙醇对经６０％的乙醇提取后的残渣进行提取。合并上述各浓度的乙醇提取液，减压蒸馏浓缩，将浓缩液－７０ ℃下过夜后，真空干燥２７ ｈ，取出冷冻粉，加入９５％的乙醇，以１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ，收集上清液，即为乙醇提取液，测定其体积，置于４ ℃下，待用。

收集上述步骤的沉淀，加入适量Ｈ２Ｏ后摇匀，待沉淀溶解后，以１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ，去上清，将上清液与蒸馏水提取物溶液合并到一起，即为水提取液，记录总体积，并置于４ ℃下待用。

１．３．２ 黄酮类化合物的测定 准确称取在１０５ ℃下干燥至恒重的芦丁标准品３０ ｍｇ于１００ ｍＬ容量瓶，用６０％的乙醇溶解后定容，即为０．３ ｍｇ／ｍＬ的芦丁标准溶液。准确移取芦丁标准溶液６ ｍＬ，加入质量分数为５％ ＮａＮＯ２溶液０．６ ｍＬ，混匀后静置６ ｍｉｎ，再加入100 mg/L的Ａｌ（ＮＯ３）３溶液０．６ ｍＬ，混匀后静置６ ｍｉｎ；然后加入１ ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ溶液４ ｍＬ，混匀后静置１５ ｍｉｎ。以未加入芦丁的溶液作为空白溶液，于３００～９００ ｎｍ下扫描，其最大吸收波长为５１５ ｎｍ。

分别准确移取０．０、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０ ｍＬ芦丁标准溶液于２５ ｍＬ容量瓶中，加入６０％的乙醇补充至６ ｍＬ，然后同上述“加入质量分数５％ ＮａＮＯ２溶液０．６ ｍＬ……静置１５ ｍｉｎ”步骤。以０号组作对照，设３个平行。

将样品水提取液稀释１０倍后，精确吸取０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０ ｍＬ于１０ ｍＬ容量瓶中，其余步骤同上，在５１５ ｎｍ处测定吸光度。

精确吸取９５％的乙醇提取液０、０．５、２．０、３．０ ｍＬ于１０ ｍＬ容量瓶中，其余步骤同上，在５１５ ｎｍ处测定吸光度。

２ 结果与分析

２．１ 不同溶剂提取所得体积

经测定，水提取物的总体积为８１ ｍＬ，９５％乙醇提取物的总体积为１２６ ｍＬ。

２．２ 黄酮类化合物结果分析

样品在３００～９００ ｎｍ波长范围内进行扫描，检测最大吸收峰波长为５１５ ｎｍ。样品测定结果见表1，芦丁标准曲线见图1。

芦丁标准品的线性回归方程为ｙ＝１１．８９７ 0ｘ＋ ０．００４ １（ｒ＝０．９９９ ５）（图1），水提液稀释１０倍后，其线性回归方程为ｙ＝０．０２１ 0ｘ-０．０００ ７（ｒ＝０．９９７ ９）（图2），水提液的吸光度见表２，吸光度与体积变化曲线见图２，水提液中总黄酮含量为１１．０３ ｍｇ；９５％乙醇提取液的吸光值见表３，吸光度与体积变化曲线见图３，线性回归方程为ｙ＝０．０４０ ３ｘ-０．００３ ６（ｒ＝０．９９７ ０）（图3）。９５％乙醇提取液中的总黄酮含量为３．４５ ｍｇ，水溶性黄酮的量为醇溶黄酮量的３．２倍。５ ｇ枸杞干花中含有的总黄酮含量达到１４．４８ ｍｇ，即枸杞花中总黄酮含量为２．９５ ｍｇ／ｇ。

３ 结论

采摘的宁夏本地的枸杞花阴干后，对干枸杞花依次采用水、６０％、８５％、９５％乙醇在５０ ℃下超声提取５０ ｍｉｎ，将提取液经抽滤、减压浓缩后，最终得到水提取液（８１ ｍＬ）和醇提取液（１２６ ｍＬ）两种提取物。在弱碱条件下，用Ａｌ（ＮＯ３）３与黄酮类化合物反应，以芦丁作为标准品，在５１５ ｎｍ下分别测定总黄酮的含量。其中水提取物中黄酮含量为１１．０３ ｍｇ，乙醇提取物中黄酮含量为３．４５ ｍｇ，水溶性黄酮为醇溶性黄酮的３．２倍，枸杞花中总黄酮含量达到２．９５ ｍｇ／ｇ。

参考文献：

［１］ 张 英，唐玉锋，白 杰． 宁夏枸杞营养成分分析及其应用研究进展［Ｊ］． ２００９，９（４）：９－１２．

［２］ 杜 毅，高 华，班长俊，等． 枸杞的化学与药理研究新进展［Ｊ］． 内蒙古中医药，２０００，１９（４）：４０－４１．

［３］ 王 慧． 黄酮类化合物生物活性的研究进展［Ｊ］． 食品与药品，２０１０，１２（９）：３４７－３５０．

［４］ 田永利，许志宇，葛 林，等． 总黄酮类化合物含量测定方法和药理作用研究进展［Ｊ］． 河北医药，２０１０，３２（１５）：２０９４－２０９６．

［５］ 汪秋安，周 冰，单 杨． 天然黄酮类化合物的抗氧化活性和提取技术研究进展［Ｊ］． 化工生产与技术，２００４，１１（５）： ２９－３２．

［６］ 沈剑明，刘晓峰． 宁夏枸杞的花联合现象［Ｊ］． 西北植物学报，１９９０，１０（３）：２２１－２２４．

［７］ 刘兰英，曹有龙，马洋洋，等． 枸杞花花色素提取工艺研究［Ｊ］． 安徽农业科学，２０１０，38（３２）：１８１４０－１８１４１．

［８］ 陈志红，徐美奕，龚先玲． 紫荆花黄酮类化合物体外抗氧化活性研究［Ｊ］． 化学世界，２０１０，５１（７）：４０１－４０３．

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［１０］ 吴亮亮，石雪萍，张卫明． 花椒总黄酮测定方法研究［Ｊ］． 食品工业科技，２０１０，（１０）：３７２－３７４．