草胺膦浓度对黄芩植株生长和愈伤组织生长分化的影响

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摘要：通过研究除草剂草胺膦对黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）植株生长和愈伤组织生长分化的影响，发现草胺膦对黄芩植株生长和愈伤组织生长分化具有强烈的抑制作用。并在此基础上找到了合适的草胺膦筛选压，对于黄芩植株生长是30 mg/L；对于黄芩愈伤组织生长是3.5 mg/L；对于黄芩愈伤组织分化是3.0 mg/L。

关键词：黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）；愈伤组织；除草剂；草胺膦

中图分类号：Q949.777.6；Q813.1+2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2012）20-4529-03

草胺膦（Glufosinate-ammonium）又称草丁膦，是广谱灭生性的有机磷类除草剂，其毒性低、活性高、用量少、环境压力小、使用安全方便。草胺膦的活性成分为（RS）-2-氨基-4-（羟基甲氧瞵基）丁酸铵（Phosphinothricin，PPT）。PPT能通过抑制植物体内惟一解氨毒的谷氨酰胺合成酶（GS）活性，抑制细胞内氨的同化作用，从而导致氨的迅速积累，最终引起叶绿体解体、细胞死亡[1-4]。该除草剂有2种同分异构体，其中D型不具除草剂活性，L型（L-PPT）是主要活性成分[5]。

草胺膦抗性基因bar是目前作物转基因中用得最多的抗除草剂选择标记基因之一，具有快速、简便、高效等优点已成功地用于大豆、小麦、水稻、玉米、大麦、甜菜、棉花、油菜等作物[6]。bar基因能消除PPT对植物体的毒害作用，它编码草胺膦乙酰转移酶PAT，使乙酰辅酶A与草胺膦游离氨基结合，形成AC-PAT复合物，使草胺膦失去活性，从而使植株具有草胺膦抗性[7]。因此，对种植的含有bar基因的作物田间喷施PPT，能有效地防除杂草，减少除草剂用量及其在土壤中的残留，生产成本明显降低，国外已大面积推广种植[8]。到目前为止，在人食用和动物饲养方面尚未出现副作用[9]。以bar基因构建的转基因载体转化宿主细胞后，只要在选择培养基中加入一定量的除草剂，就能杀死非转化细胞，生存下来的就是含有目的基因的转化细胞，故能迅速、简便、有效地检测转基因植株，减少假阳性植株，进而降低了鉴定转基因的工作量[10]。

黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）为唇形科黄芩属植物，其药用部位为干燥根，具有清热燥湿、凉血安胎、泻火解毒的功效，是中国传统的重要大宗中药材。对黄芩生物技术的研究有助于黄芩产量和品质的提高。试验研究了不同浓度草胺膦对黄芩植株生长和愈伤组织生长分化的影响，并据此确定合适的筛选压，为bar基因作为选择标记基因的黄芩基因转化试验打下了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料与试剂 黄芩种子由中国中医科学院中药研究所黄璐琦实验室提供，植株为种子无菌发芽长成的黄芩无菌苗，愈伤组织为黄芩无菌苗茎段诱导所得。分析纯草胺膦购自Sigma公司，其他试剂均为国药集团化学试剂有限公司的沪试牌分析纯试剂。

1.1.2 培养基 以MS培养基为基本培养基。愈伤组织继代培养基：MS+30.0 g/L蔗糖+7.0 g/L琼脂粉+0.1 g/L肌醇+0.3 g/L水解酪蛋白+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；愈伤组织分化培养基：MS+30.0 g/L蔗糖+7.0 g/L琼脂粉+0.1 g/L肌醇+0.3 g/L水解酪蛋白。按试验方法添加不同浓度的草胺膦，高压灭菌前调至pH 5.8～6.0，于121 ℃高压灭菌18 min，冷凝后待用。

1.2 方法

1.2.1 草胺膦对植株生长的影响 把浓度为0、5、10、15、20、30 mg/L的草胺膦稀释液分别涂抹在黄芩植株的叶片上，接在MS培养基上，将不涂草胺膦的设为对照，置于25 ℃培养室中，以15 h/d光照培养，1个月后观察草胺膦对黄芩植株生长的影响。

1.2.2 草胺膦对愈伤组织生长的影响 选取生长疏松的淡绿色黄芩愈伤组织分别接种在草胺膦浓度为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/L的继代培养基上，每种浓度梯度的培养基接种6瓶，每瓶接入7粒愈伤组织。置于25 ℃培养室中，以15 h/d光照培养，1个月后观察记录愈伤组织的生长、褐化和死亡情况。

1.2.3 草胺膦对愈伤组织分化的影响 将继代培养且生长疏松的淡绿色愈伤组织分别接种在草胺膦浓度为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/L的分化培养基上，每种培养基接种6瓶，每瓶接入7粒愈伤组织。置于25 ℃培养室中，以15 h/d光照培养，观察愈伤组织的分化情况。培养2～3周后，统计愈伤组织的分化率。

2 结果与分析

2.1 草胺膦对黄芩植株生长的影响

接种植株一月后观察植物的外观性状。由表l可知，黄芩植株对草胺膦有一定的天然耐受性。在草胺膦浓度低于10 mg/L时，植株生长基本不受影响；当浓度达到10 mg/L，叶片开始出现枯斑；当草胺膦浓度达到30 mg/L，叶片才完全枯死。因此在进行黄芩转bar基因抗性植株的筛选时，草胺膦的浓度应该大于30 mg/L，以避免假阳性植株的出现。

2.2 草胺膦对愈伤组织生长的影响

由表2可知，在加有除草剂草胺膦的培养基上，愈伤组织增殖率明显下降，随着除草剂浓度的升高，愈伤组织褐化率也相应增高，大多数愈伤组织直接褐化死亡；存活的愈伤组织疏松程度逐渐降低，增殖受到影响。当草胺膦浓度为1.0 mg/L时，愈伤组织的褐化率只有23.8%；当草胺膦浓度上升至4.0 mg/L时，愈伤组织的生长受到了明显的抑制。没有分化的愈伤组织褐化坏死。当草胺膦浓度为3.5 mg/L时，褐化率为95.2%，是较为合适的筛选浓度。

2.3 草胺膦对愈伤组织分化的影响

为了进一步确定草胺膦对黄芩愈伤组织分化的影响，挑取各种浓度草胺膦下未褐化死亡的细胞进行再分化，由表3可知，当草胺膦浓度为3.0 mg/L时，尚有极少数愈伤组织能形成绿点，并最终形成幼苗，当草胺膦浓度大于3.0 mg/L时，却没有绿点形成，也没有苗形成。可见3.0 mg/L草胺膦对黄芩来说已经是有效的抑制分化浓度了，故在进行黄芩转bar基因抗性愈伤组织分化的筛选时，草胺膦的浓度以3.0 mg/L较为合适。

3 讨论

草胺膦是一种非选择性除草剂，具有杀草谱广、低毒、内吸好、活性高和环境相容性好等特点，也是全球第二大转基因作物耐受除草剂，应用前景十分广阔[11]。不同植物对草胺膦的耐受性不同。在植物转基因试验过程中，需要研究目标植物对该除草剂的耐受性。

试验结果显示除草剂草胺膦对黄芩愈伤组织的抑制作用远大于对植株的作用。对愈伤组织，草胺膦浓度为3.0～3.5 mg/L可以有效抑制愈伤组织的生长分化；而对黄芩植株，草胺膦的浓度则需达30 mg/L才可以完全抑制其生长。因此，在进行黄芩转bar基因抗性植株的筛选时，草胺膦的浓度应该大于30 mg/L。

草胺膦对愈伤组织的生长和分化均有强烈的抑制作用。从试验结果可以看出，草胺膦对黄芩愈伤组织的分化比对愈伤组织的生长具有更强的抑制作用，在同一种草胺膦浓度下，愈伤组织分化的褐化速率大于愈伤组织生长的褐化速率；草胺膦对愈伤组织分化的筛选浓度3.0 mg/L小于愈伤组织生长的浓度3.5 mg/L。

对转化后的愈伤组织，选择培养时筛选临界浓度的选择至关重要，太高可能导致愈伤组织大量死亡，太小又容易出现假阳性。因此在做转化试验时，可根据筛选临界浓度和愈伤组织生长状态来确定草胺膦的使用浓度。

参考文献：

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