狗尾草总RNA提取方法研究
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摘要 RNA是由核糖核苷酸经磷酯键缩合而成的长链状分子。RNA与DNA、蛋白质、多糖等物质普遍存在于细胞中。常用的总RNA提取的方法是Trizol法，该方法可同时分离一个样品的RNA、DNA和蛋白质，但由于植物材料中多糖多酚的存在及操作环境的影响，RNA产量偏低。QIAGEN RNeasy Plant Mini试剂盒法（胍盐法）是通过裂解液（不含苯酚、氯仿）裂解细胞，使RNA和DNA同时通过柱子，再将其分离的总RNA提取法。该方法既克服了Trizol在多糖多酚存在的情况下不能成功分离RNA与DNA的弊端，又保证在提取过程中不使用苯酚氯仿等有毒试剂，并且能在一定程度上提高RNA的产量和纯度。
中图分类号 S713 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2012）22-0156-01
Trizol法、硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法都是提取RNA的常用方法，其中Trizol法最为常用。Trizol使样品匀浆化，细胞裂解，释放细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可防止RNA降解，在一定程度上保证了RNA的完整性。加入氯仿，样品发生分层。RNA存在于上层水相，可用异丙醇沉淀回收；DNA存在于中间层，可用乙醇沉淀回收；蛋白质存在于下层有机相，可用异丙醇沉淀回收。因此，该方法可以同时分离一个样品中的RNA、DNA和蛋白质。Trizol法在提取动物组织RNA时颇为有效，但在多糖多酚含量较多的植物样品中，因其无法抑制多糖多酚对DNA和RNA分相的干扰，即可能造成DNA或者多糖多酚次级代谢产物的大量残余，影响抽提的总RNA的纯度。直接裂解过柱子的方法是目前最先进的方法，包括Qiagen的RNeasy plant mini kit盒子。该试验对QIAGEN RNeasy Plant Mini试剂盒法（胍盐法）进行了研究，拟比较其与Trizol法的优劣，以探索更好的RNA提取方法。
1 材料与方法
1.1 试验材料
植物材料：狗尾草新鲜叶片。试剂与仪器：QIAGEN RNeasy Plant Mini试剂盒、液氮、研钵、离心机、电泳仪。
1.2 试验方法
称取新鲜狗尾草叶片组织不超过100 mg，在预冷的研钵中研磨成细粉，转移到2 mL EP管中。①待液氮挥发完毕，在样品未解冻状态下加入450 mL提取缓冲液RLT，立即剧烈震荡，充分涡旋。注意RLT应加入1/100体积的14.5 M β-巯基乙醇，该过程也可在56 ℃温育1~3 min；②将裂解液全部转移到淡紫色柱子中，全速离心2 min，小心吸取上清至新管中。注意该步中裂解液被均质化，细胞碎片、蛋白质等大分子物质吸附在柱膜上，小分子在上清中，故应小心吸取上清，勿吸到沉淀；③在新管中加入1/2样液体积的无水乙醇，立即吹打混合。将混合后的约650 μL样液，包括形成的所有沉淀转移到粉红色管中，轻柔的盖上离心管盖子，≥10 000 r/min，离心15 s，弃掉下清液；④向粉红色管中加入350 μL RW1缓冲液，≥10 000 r/min，离心15 s，冲洗离心柱，弃下清；⑤向粉红色管中加入700 μL RW1缓冲液，≥10 000 r/min，离心15 s，冲洗离心柱，弃下清；⑥将离心柱转移到一新的2 mL收集管上，加入500 μL RPE液，≥10 000 r/min离心15 s。弃去管内液体，重复使用收集管。注意：试剂盒提供浓缩的RPE洗脱液，使用前必须加入4倍体积的96%~100%乙醇；⑦向柱中加入500 μLRPE液，≥10 000 r/min离心2 min，冲洗滤膜，干燥离心柱，弃掉下清液。注意该步需保证无乙醇残留，否则影响后面的试验；⑧将吸附柱放入新的1.5 mL回收管中，加入30～50 μL的RNase-free water到柱中，≥10 000 r/min离心1 min，释放RNA。注意若RNA产量在20 μg以上，用30~50 μL无RNase水再洗脱1次。RNA样品存于-20 ℃或-80 ℃冰箱；⑨用高精度无需比色皿分光光度计测定RNA的含量；琼脂糖凝胶电泳检测[1-3]。
2 结果与分析
采用高精度无需比色皿分光光度计测定RNA的含量，QIAGEN RNeasy Plant Mini试剂盒提取的狗尾草RNA含量为6 080 ng/μL，Trizol法提取的狗尾草RNA含量为1 004 ng/μL。由图1可以看出，1、2泳道的条带比后面泳道的条带要亮，且少有降解。由此表明，用QIAGEN RNeasy Plant Mini试剂盒提取简单植物组织RNA确实比较有效。
3 结论与讨论
通过对比2种方法提取出的RNA产量和纯度，发现用QIAGEN RNeasy Plant Mini试剂盒提取简单植物组织RNA确实比Trizol法有效。该方法是通过裂解液裂解细胞，该裂解液含有RNase抑制剂，不含有氯仿、苯酚等有毒物质。通过离心分离细胞碎片，过淡紫色柱子过滤出多糖及蛋白质，分离出RNA与DNA结合相，继而通过粉红色柱吸附RNA，对RNA和DNA进行分离，达到抽提RNA的目的。该方法添加去多糖多酚代谢产物的成分，在一定程度上提高了RNA的产量，较Trizol法避免在多糖多酚下对DNA和RNA分离的干扰。另外，由于DNA和RNA同时结合在柱膜上，所以除去DNA也是一个要点[4-6]。
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