金龙蛇颗粒对原位移植人MKN-45胃癌组织基因表达谱的影响

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摘要：目的：利用基因表达谱芯片研究金龙蛇颗粒对MKN－45胃癌的分子机制。方法：抽提经金龙蛇颗粒治疗的裸鼠原位移植人MKN－45胃癌组织和生理盐水阴性对照的瘤组织总RNA并纯化mRNA，分别逆转录并进行荧光标记，制作成cDNA探针，与包含4096个人类基因的cDNA表达谱芯片进行杂交，筛选出两组间差异表达基因。结果：在mRNA水平上，筛选出包括与DNA结合、转录和转录因子、蛋白翻译、细胞周期等相关表达差异的基因共341条，其中44条(比值>2)表达上调(占12.9％)，297条(比值

关键词：金龙蛇颗粒；基因表达谱芯片；入MKN－45胃癌细胞系；胃肿瘤；中医药

中图分类号：R285.5　文献标识码：A　文章编号：1673－7717(2007)09－1934－05

金龙蛇颗粒由南星、半夏、鸡内金等组成，是魏品康教授在抗胃癌有效方“消痰散结方”的基础上的进一步改进，前期体内研究表明金龙蛇颗粒有较好的抑瘤效果，能够阻滞胃癌细胞由G1期进入S期，诱导胃癌细胞凋亡。本研究在前期抑瘤有效的基础上，利用基因表达谱芯片从分子机制研究金龙蛇颗粒对MKN－45胃癌组织具体作用机制，从而为中药抗肿瘤作用的分子机理提供新思路。

1　材料和方法

1．1　实验材料

1．1．1　实验动物和药物BALB/C裸鼠20只，雌雄各半，20－22g，由中科院上海动物中心提供，实验动物使用许可证号：SYXK(沪)20040－001，实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2003－0003。实验动物饲养于SPF条件下，自由饮食。实验瘤株：入胃低分化腺癌MKN－45细胞株，由中科院上海细胞生物研究所提供，本组瘤源为第6代；金龙蛇颗粒水煎膏原生药购自上海雷允上公司，产地明确，由第二军医大学长征医院制剂室制备成含生药浓度为6g/mL的水煎膏，临用时用蒸馏水配制相应的浓度。

1．1．2　造模相关材料和试剂　OB生物胶，广州白云医用胶有限公司生产，批号040514；氯胺酮注射液，江苏恒瑞医药有限公司生产，批号：02072332。BiostarH－40s cDNA表达谱芯片，上海博星基因芯片有限责任公司公司产品，包含4096个人类基因。

1．2　实验方法

1．2．1　裸鼠原位移植胃癌模型的建立　该模型为本实验室所创。具体为：从MKN－45细胞瘤株的裸鼠剥取肿瘤，选取生长良好的瘤组织，置于生理盐水中切成直径1mm×1mm×1mm小块，备用。裸小鼠常规消毒，氯胺酮(50mg/kg)腹腔麻醉后固定于特制的裸鼠固定台上，沿腹中线剑突下依次剪开皮肤、腹肌，切口约1cm，暴露腹膜及胃壁；在胃大弯中部用注射针头小心划破胃浆膜面，以不出血为度，将组织块植入，滴1滴医用OB生物胶。约40s凝固后以3/0丝线分别缝合腹膜及皮肤切口。裸鼠造模48h后随机分成2组，每组10只，模型对照组生理盐水灌胃，金龙蛇颗粒按60g/kg进行灌胃，上述2组均每天灌胃1次，每次0.4mL，每周6天，共6周。给药6周后将上述两组裸鼠脱颈处死，剥取肿瘤组织，称重后迅速投人液氮中以备抽提总RNA用。

1．2．2　基因表达谱检测　总RNA抽提取出冰冻于液氮中的肿瘤组织，采用Trizol一步法抽取总RNA，并通过琼脂糖凝胶电泳检测以确定所抽取的总RNA纯度。

基因芯片检测：方法反转录标记cDNA探针并纯化。用cy3－dUTP标记模型对照组RNA，cy5－dUTP标记金龙蛇颗粒组RNA，将探针混合后与基因芯片进行预杂交，具体步骤按照BiostarH－40s基因芯片说明书进行。通过图像处理软件GenePix Pro 3.0处理分析两组基因表达的差异。

基因芯片分析方法：通过芯片图像分析软件对芯片灰度扫描图进行分析，可以得到芯片上每个基因点的原始信号值，包括前景信号值和背景信号值。用基因点Cy5信号的前景信号值减去它的背景信号值，得到该基因点的cy5信号的实际强度值；为了避免弱信号对实验结果的干扰，将所有小于200的cy5信号值用200替代。用基因点Cy3信号的前景信号值减去它的背景信号值，得到该基因点的Cy3信号值。为了校正Cy5、Cy3标记体系间的系统误差，实验数据要进行均一化处理。均一化处理时先依据以下2个原则筛选出参与均一化处理的有效基因点：1)该基因点的Cy3、Cy5信号值皆大于200，或者其中之一大于800；2)该基因点的Cy5信号N/Cy3信号值的比值在0.1－10之间。计算每个有效基因点Cy5信号值/Cy3信号值的比值，然后求出其相应的自然对数值r=ln(Cy5/Cy3)，算出全部有效基因点r值的平均值R，实验的均一化系数就等于R的倒数即EXP(R)。通过上述过程的计算，本次实验的均一化系数为：0.934。将所有基因点的Cy3信号值乘上均一化系数，得出调整后的Cy3*。并且，为了避免弱信号对实验结果的干扰，将所有小于200的Cy3*值以200取代。计算每个基因点在本次实验中的表达差异值Ratio，Ratio=CyS/cy3*。筛选出Ratio大于2或小于0.5的基因点，这些数据所代表的基因在与两种探针杂交时表现出较大的差异。

2　结　果

2．1　琼脂糖电泳检验

用于芯片研究的各组细胞RNA OD260/OD280值在1.9－2.0之间。1％琼脂糖凝胶电泳28S和18S条带清晰，无DNA杂带，热稳定实验70℃水浴后电泳条带无明显改变。证明已抽提得到高纯度的总RNA。

2．2　基因表达检测

基因芯片共有393条基因表达有差异，占全部4096点基因的9.59％，其中表达上调的有46条，占393条差异表达基因的11.7％，347条表达下调，占全部393条基因的88.30％。为了进一步确定这些基因的功能，笔者根据基因芯片上的unigene号重新链接到了pubmed数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez，截至2006－01－15)，对393条差异表达基因进行了进一步的筛选，剔除了unigene中已经不用的基因。经过筛选，初步确定了341条差异表达基因的功能，并进行了分类，其中上调基因为44条，下调基因为297条。这些基因涉及了原癌基因、抑癌基因，离子通道运输蛋白，细胞周期，细胞凋亡相关蛋白，DNA合成、修复和重组，DNA结合、转录和转录因子，细胞受体、代谢、细胞信号传递蛋白等15个不同的种类。

3　讨　论

和大多数实体瘤一样，胃癌的发生、发展和转移是一个多因素、多阶段的多基因调节失衡过程。虽然近年来一些

发达国家和大中城市胃癌的发生率和死亡率有下降的趋势，治疗手段也众多，但胃癌的5年生存率仍只有20％左右，即使目前的分子靶向药物其有效率也仅在10％左右，探寻有效、安全的，针对多基因、多层次的胃癌治疗方法和药物仍具有重要的意义。中药复方是建立在中医理论和辨证论治的基础上形成的，其毒副作用相对较小，具有多靶点、多层次作用的特点，因此开发出行之有效的代表中医疗效特点的复方是未来中医生存和发展的重要内容。

本研究中笔者筛选出了341条差异表达基因，这些基因的功能涉及细胞生命活动的各个方面，通过对这些基因的功能进行分析，笔者初步认为金龙蛇颗粒抗胃癌的基因途径可能多环节、多层次的结果。主要体现在以下几个方面：(1)调控与细胞周期相关基因的表达：如下调了与G1期相关的RB基因和产物的表达，导致RB蛋白磷酸化不足，因而与E2F结合能力加强，限制了E2F的促进细胞周期的基因转录的功能，因而阻滞了MKN－45胃癌细胞由G1期向S期转变；下调了S期的p45基因和G2/M期的CDC25B和CDK9等基因。因此，从笔者的结果来看，金龙蛇颗粒可能对MKN－45胃癌细胞的各个周期都有作用。尤其值得注意的是金龙蛇颗粒能够下调泛素一蛋白酶体系统中相关基因的表达。如泛素活化酶(E1)相关基因UBE1L、泛素偶联酶(E2)相关基因UBE2G2和UBE2V2，泛素一蛋白连接酶(E3)相关基因ITCH。已知泛素－蛋白酶体系统是一种高效的细胞内蛋白降解途径，该途径主要由泛素、泛素活化酶、泛素偶联酶、泛素一蛋白连接酶、26S蛋白酶体、泛素再循环酶等组成。在细胞周期诸多环节中，这些蛋白不仅及时地合成、而且及时地降解，对周期演进都是不可或缺的，泛素化可能对一些作用后的周期相关蛋白起到及时的降解而促使细胞进入下一阶段，抑制蛋白酶体可引起肿瘤细胞周期停滞和凋亡。由于蛋白泛素化与细胞周期调节及癌症的关系近年来日渐引起关注，因而这个结果值得进一步深入研究。

(2)调控与细胞凋亡相关的基因表达：实验中，肿瘤坏死因子家族中肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(TNFAIP3)表达上调，TNF配体超家族10(TNFSF10)、肿瘤坏死因子受体超家族10a(TNESF10A)、肿瘤坏死因子受体相关因子5(TRAF5)以及Fas相关酪氨酸非受体型13激酶(PTPN13)表达下调；Bcl－2基因家族中凋亡抑制基因BAG5、双功能凋亡调节物(BFAR)和凋亡相关蛋白3(THAF3)表达下调，凋亡促进基因BCL9L和BAD表达上调；终末蛋白酶中上游的caspase－8和下游的caspase－6表达下调。特别是与caspase途径密切相关的胰岛素样生长因子结合蛋白3基因(IGFBP3)也表达上调，有人报道，IGFBP3在P53参与的DNA修复中起到很重要的作用，对细胞生长呈现负调控作用。

(3)对细胞黏附、肿瘤生长、转移和血管生成相关基因的调控作用：如下调了与细胞黏附相关的ICAM－1、蛋白聚糖4(PRG4)、层粘连蛋白γ1(LAMC1)、小窝蛋白2(CAV2)、组织蛋白酶E和S(CTSS，CTSE)、透明质烷和蛋白聚糖连接蛋白1(HAPLNI)等基因产物，下调了与肿瘤生长和转移，血管生成密切相关的表皮生长因子家族(EGFL4)，成纤维生长因子12(FGF12)，血小板激活因子(PAFAH1B1)等，而胰岛素样生长因子3(IGFBP3)出现了上调。已知在大多数肿瘤中，表皮生长因子、成纤维生长因子表达均上调，以便于持续刺激细胞生长，而胰岛素样增长因子则对细胞生长呈现负调控作用。这些实验结果提示金龙蛇颗粒能够调控细胞间质相关成分，进而产生抑瘤和抗转移的作用的。

(4)对Ras家族和蛋白酪氨酸激酶家族信号转导的调控作用：本实验结果显示，金龙蛇颗粒能够下调Ras家族相关基因和产物的表达，如Rho相关蛋白激酶2(ROCK2)，Rho GTP酶激活蛋白15(ARHGAP15)，RhoGEF激酶(KALRN)，RAS癌基因家族成员1(RAB7L1)，IQ基序包含的GTP酶激活蛋白2(IQGAP2)，发育调节的GTP结合蛋白2(DRG2)等基因均表达下调。目前已知，Ras基因在正常细胞生长、分化，细胞骨架，蛋白转运等一系列细胞生命活动中发挥重要的作用，其产物为编码一种鸟苷酸结合蛋白，分子量为21kDa(通常命名为p21)。在肿瘤中，ras基因经常发生12、13和61位点突变，突变后的ras蛋白水解三磷酸鸟苷(GTP)为二磷酸鸟苷(GDP)能力下降，也降低了自身内源性鸟苷酸三磷酸酶(GTPase)的活性，更重要的是还降低了它们与GTPase活化蛋白(Ras－GAP)的结合能力，其结果是导致Ras蛋白与GTP的持续结合并促进细胞失控性生长。许多文献报道，胃癌中Ras基因及其产物表达有异常。这可能是金龙蛇颗粒抑制胃癌细胞生长的机制之一，这一结果也与笔者前期的实验结果相一致的。另外，信号转导中酪氨酸家族的蛋白酪酪氨酸受体蛋白(PPFIA4)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、fps/fes相关的酪氨酸激酶(FER)、蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型13(PTPN13)，G蛋白偶联受体家族的G蛋白β5(GNB5)、G蛋白偶联受体4、G蛋白偶联受体激酶调节蛋白2(GIT2)，第二信使中的cAMP和cGMP等基因表达也出现了差异。这些结果表明金龙蛇颗粒的抗肿瘤作用可能是通过多通路、多层次、协同作用而产生的。

(5)较令人难以解释的是细胞因子普遍上调，特别是IL－8基因的mRNA表达明显上调，这个结果与大多数文献的报道不相符，但Yang等应用基因芯片研究蛋白酶体抑制剂MG132对PC3前列腺癌基因表达谱中也出现IL－8表达上调，他们推测可能是由于MG132同时激活了NF－κB途径导致IL－8表达上调；另外，有人报道，虽然在大多数肿瘤中IL－8都高表达，但由于IL－8具有趋化中性粒细胞、T细胞和NK细胞的作用，可以在肿瘤局部产生抗肿瘤作用，而且IL－8受到各种肿瘤微环境如缺氧、酸中毒、NO和细胞密度的影响，以及受到NF－κB激活的调控，而TNF途径的激活又同时会间接激活NF－κB，因而金龙蛇颗粒上调IL－8的mRNA的表达可能受到多种因素的调节，值得进一步研究。类似的结果在笔者基因芯片中还有趋化因子(C－X－C基序)配体9(CXCL9)基因、IL－13受体(IL13RA2)、趋化因子受体4(CXCR4)等基因mRNA表达上调，集落刺激因子3受体亚型(CSF3R)、IL－10受体β(IL10RB)、细胞因子受体样因子3、干扰素(α、β、Ω)受体1(IFNAR1)等表达下调。由于缺乏其他佐证，因而这些结果都难以连贯起来解释笔者目前的实验结果，因此值得今后做进一步的深入研究。

总之，本实验中发现的差异表达基因，为进一步研究金龙蛇颗粒的抗胃癌作用的分子机理提供了具体的线索，也为中药抗肿瘤机理提供了一条新的思路。