桑叶中多糖和总黄酮的含量测定
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摘要：目的：分析测定桑叶中的多糖和总黄酮含量，为桑叶资源的利用提供科学依据。方法：采用超声波法、索氏提取法和水煮法多种提取方法及分光光度法测定桑叶中多糖和总黄酮含量。结果：超声波法中测得的桑叶多糖和总黄酮含量最高分别为2.49%、1.402%。结论：不同提取方法中桑叶多糖和总黄酮含量差异较大，在桑叶开发及利用时应注意提取方法对多糖和总黄酮含量的影响。
关键词：桑叶；多糖；总黄酮
中图分类号：R284 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2011）-03-0073-2
桑叶（Mulberry leaves）异名铁扇子，为桑科（Moraceae）桑属植物桑(Morus alba L.)的叶[1]。初霜后采收，除去杂质，晒干。桑叶甘、苦、寒。归肺、肝经。具有疏散风热，清肺润燥，清肝明目的作用。用于风热感冒，肺热燥咳，头晕头痛，目赤昏花，收载于2010版中国药典(一部)[2]。近年来国内外很多研究结果表明桑叶具有很好的降血糖功能，在临床常用桑叶或桑叶为主的处方治疗糖尿病，并取得满意效果[3]，现代药理研究证明桑叶可以抑制血糖上升，防治和治疗糖尿病[4-7]。桑叶中含有黄酮及其苷、生物碱、多糖、挥发油、各种氨基酸、微量元素等[8]，成分比较复杂，黄酮类成分是主要有效成分之一[9]。多糖作为一种生物活性物质，在诸多方面有着重要作用，特别在医学方面应用更为广泛。但目前对桑叶中多糖的研究甚少，因而桑叶的许多潜在价值并没有被人们充分认识。笔者采用分光光度法首次测定了不同提取方法中桑叶多糖和总黄酮含量，为桑叶资源的合理开发利用提供科学依据。
1 仪器和材料
BUCHI旋转蒸发仪（瑞士BUCHI），JA1203N型电子天平（上海精密科学仪器有限公司），SXT-06型索氏提取器（上海），KQ-250B型超声清洗机（昆山市超声仪器有限公司），UV-1700分光光度计（日本岛津），TDL-5离心机（上海安亭科学仪器厂）等。
芦丁标准品购自中国药品生物制品检定所，葡萄糖购自上海生物制品研究所，乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠、葡萄糖、苯酚、浓硫酸、石油醚、三氯醋酸、正丁醇、三氯甲烷等。以上试剂均为分析纯。
桑叶由湖北省咸宁市中药材公司提供，经鉴定为桑科植物桑(Morus alba L.)的干燥叶。
2 方法和结果
2.1 标准品溶液的制备
2.1.1 芦丁对照品溶液 精密称取120℃干燥至恒重的芦丁对照品为19.84mg，加85%乙醇溶解，定容至100ml容量瓶中，摇匀，制成0.1984mg/ml的芦丁对照品溶液。
2.1.2 葡萄糖对照品溶液 精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖对照品50.0mg于50ml容量瓶中，加水溶解至刻度，摇匀，即为葡萄糖对照品溶液。
2.2 供试品溶液的制备
2.2.1 超声波法提取黄酮及多糖 精密称取研碎的桑叶5g，置100ml锥形瓶中，加85%乙醇100ml，超声提取3次，每次30min。过滤，并用少量85%乙醇多次洗涤滤渣，合并提取液，并转入50ml容量瓶中，以85%乙醇定容，即得待测桑叶总黄酮的供试品液Ⅰ。将提尽黄酮后的残渣置100ml锥形瓶中，加80%乙醇100ml，超声提取20min，以除去单糖及一些苷类。待残渣中的乙醇挥干后，加水100ml超声提取3次，每次30min，过滤，合并3次滤液，然后定容于50ml的容量瓶中，即为待测桑叶多糖的供试品液Ⅱ。
2.2.2 索氏提取法提取黄酮及多糖 精密称取研碎的桑叶5g，置索氏提取器中，用石油醚(60-90℃) 水浴回流脱脂17h，残渣挥干溶剂后，置100ml锥形瓶中，加85%乙醇100ml，超声提取3次，每次30min。过滤，并用少量85%乙醇多次洗涤滤渣，合并提取液，并转入50ml容量瓶中，以85%乙醇定容，即得待测桑叶总黄酮的供试品液Ⅲ。将提尽黄酮后的残渣置100ml锥形瓶中，加80%乙醇100ml，超声提取20min，以除去单糖及一些苷类。待残渣中的乙醇挥干后，加水100ml超声提取3次，每次30min，过滤，合并3次滤液，然后定容于50ml的容量瓶中，即为待测桑叶多糖的供试品液Ⅳ。
2.2.3 水煮法提取多糖和总黄酮 取两份5g干桑叶，分别用研钵磨碎(越细越好)，加水在恒温水浴锅内浸提60min（两次）。用旋转蒸发仪在69℃下蒸发浓缩至40ml，其中一份为供试品液Ⅴ，另一份加4ml10%三氯醋酸，放置数小时，离心除去不溶物。取上清液浓缩至10ml，加40ml的95%乙醇，经48h冰箱过夜沉淀，取出后，在离心机上12000r/min离心分离15min，去上清液，将沉淀转溶于蒸馏水中，用Sevag法除蛋白，即用三氯甲烷：正丁醇为4：1的混合液，在分液漏斗中萃取3次，每次取混合液10 ml萃取。取上清液，加活性炭脱色处理，再离心15min，去除杂质沉淀。取上清液定容100ml，即为待测桑叶多糖的供试品液Ⅵ。
2.3 标准曲线的绘制
2.3.1 黄酮标准曲线的制备 分别取芦丁对照品溶液0.0，0.2，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0ml于10ml容量瓶中，加5%亚硝酸钠0.4ml，放置6min，加10%硝酸铝0.4ml，放置6min，再加4%氢氧化钠4ml，加水至刻度，摇匀，放置15min，在510nm处测定其吸光度值；以吸光度值为横坐标，样品浓度为纵坐标，绘制标准曲线，计算得标准回归方程y=8.3483x-0.011，r2=0.9991，在0.003968-0.07936mg/ml范围内呈良好的线性关系。
2.3.2 多糖标准曲线的制备 分别精密移取葡萄糖对照品溶液 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5ml于50ml容量瓶中，加水稀释至刻度，各取1.0ml于10ml比色管中，分别加入5%苯酚溶液1.0ml，摇匀，加入5.0ml浓硫酸(加入浓硫酸时，将移液管口悬于试管口，使浓硫酸垂直冲入液面)，立即摇匀，沸水浴加热10min，用冰水冷却至室温，以蒸馏水同法作空白参比，在485nm处测吸光度值(A)。以其吸光度值为横坐标，浓度(C)为纵坐标，绘制标准曲线，得线性方程y=43.925x-0.0113，R2=0.9961，在0.002875-0.014286mg/ml范围内有良好的线性关系。
2.4 样品含量的测定
2.4.1 黄酮含量测定 精密吸取黄酮供试品液1.0ml，置25ml容量瓶中，用85%乙醇定容至刻度，再取2.0ml，定容至10ml按硝酸铝显色法显色，测定A值，计算出样品总黄酮含量，结果见表1。
2.4.2 多糖含量测定 精密吸取多糖供试品液1.0ml，置25ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，按2.3.2项下方法显色并测定吸光度值，计算出样品多糖含量，结果见表1。
表1 桑叶中总黄酮和多糖的含量测定结果
从表1中可以发现，超声提取法、索氏提取法和水煮提取法，这三种方法提取总黄酮和多糖时，超声波法测得的桑叶多糖和总黄酮含量最高，分别为2.49%和1.402%。
3 结论
分析测定结果表明，超声波法测得的桑叶多糖和总黄酮含量最高分别为2.49%和1.402%。有报道桑叶中多糖类也是主要的活性成分，桑叶总多糖具有良好的降糖效果[10]，因此，本文对桑叶多糖和总黄酮的提取方法进行了研究，以便更为充分、更为有效地对桑叶加以利用，为桑叶药材的质量控制提供参考依据。同时也为桑叶降糖作用、抗氧化活性等的机制研究和临床应用提供一定的科学依据，至于各组分中具有哪些具体的化学成分，具有哪些活性，以及有无其他机制等诸多研究课题，有待于进一步深入探讨。
参考文献
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[10] 陈福君,卢军,张永煜.桑的药理研究(Ⅰ)――桑叶降血糖有效组分对糖尿病动物糖代谢的影响.沈阳药科大学学报,
1996,13(1):24.
作者简介：张强（1983-），男，吉林长春人，吉林农业大学研究生学院中药学专业08级在读硕士研究生，研究方向：天然药物化学与产品开发。
通讯作者：张晶（1971-），女，吉林农业大学教授，研究方向：天然产物化学研究与开发。