五色梅叶内生真菌YJ—11的分离鉴定及其抑菌活性
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摘要：从广东药用植物五色梅（Lantana camara L.）叶片中分离到一株内生真菌YJ-11，通过显微形态特征观察鉴定属于青霉属（Penicillium sp.）。液态静置培养后，进行有效成分提取，获得其菌丝体甲醇提取物和发酵培养液乙酸乙酯提取物。体外抑菌试验结果表明，两种提取物对供试细菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureu）均具显著抑菌活性。
关键词：五色梅（Lantana camara L.）叶片；内生真菌；青霉属（Penicillium sp.）；抑菌活性
中图分类号：Q939.96；R93 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）24-6048-03
自从1929年弗莱明发现青霉素以来，微生物活性代谢产物成为药物的丰富源泉，现代几乎所有临床应用的抗生素都来源于微生物。近年随着新病原菌和新病毒的不断出现，癌症和心血管病的不断增加，特别是随着药物的滥用，导致病原微生物产生了抗药性，人们迫切需要寻找到新的疗效显著而毒副作用小的天然药物。植物内生菌[1]生活在植物组织内部，与宿主协同进化，二者形成了互惠关系，一方面植物为内生菌提供光合作用产物和矿物质，另一方面内生菌的代谢物能刺激宿主植物的生长发育，增强宿主植物对生物胁迫和非生物胁迫的抵抗能力。内生菌不仅能够参与植物次生代谢物的合成或对植物次生代谢物进行转化，而且还能够独立产生丰富的次生代谢产物。Stierle等[2]报道从太平洋短叶红豆杉（Taxus brevifolia）树皮中分离到的内生真菌Taxomyces andreanae能产生抗癌活性物质紫杉醇。Strobel等[3]发现植物内生真菌Gliocladium roseum（NRRL 50072）可以产生生物柴油。植物内生菌已引起研究者们的极大兴趣[4-7]，并寄希望于从中发现具有特殊功能、疗效显著、毒副作用小的新颖药物先导物。
五色梅（Lantana camara L.）[8]又名马缨丹，为马鞭草科（Verbenaceae）马缨丹属（Lantana）植物，原产美洲热带，中国南北都有引种栽培，以广东、福建、台湾、浙江、云南、四川等地为多，华南地区的荒郊野外多有大量分布。其根、茎、叶、花可作中药用，具有清热解毒、散结止痛、祛风止痒之功效；叶煎汤洗治湿疹、疥癞毒疮、皮炎、皮肤瘙痒、臃肿，捣烂敷患处能治跌打筋伤。研究表明，五色梅提取物具有抗菌、抗病毒、消炎、抗肿瘤等生物活性，其主要有效化学成分为三萜类和黄酮类化合物[9-11]，但鲜有关于五色梅内生菌研究的报道。本研究在对五色梅植物化学成分研究的基础上[12-14]，对五色梅内生真菌进行了分离，通过显微镜形态特征观察鉴定并筛选到一株内生真菌YJ-11，研究了其粗提物的抑菌活性，为进一步研究开发该菌奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 五色梅枝条，2011年10月采自佛山科学技术学院北院校区，采后10 min内带回实验室进行内生真菌的分离。
1.1.2 供试病原菌 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureu），由佛山科学技术学院微生物学教研室提供。
1.1.3 培养基 抗生素PDA培养基用于内生真菌的分离纯化，其组成为PDA培养基（国产BR级）40 g、链霉素200 mg和水1 000 mL，用NaOH调pH至7。GYP培养基用于内生真菌的液体培养，其组成为葡萄糖10 g， 蛋白胨2 g，酵母浸膏1 g，水1 000 mL，用NaOH调pH至7。LB培养基用于细菌液体培养，其组成为胰蛋白胨10 g 、酵母提取物5 g、氯化钠10 g，水1 000 mL，调节pH至7.4。肉汤琼脂培养基用于细菌固体培养，其组成为营养琼脂（普通肉汤琼脂培养基）4 g，水100 mL。
1.2 方法
1.2.1 内生真菌的分离纯化 取五色梅叶用清水洗净， 70%乙醇溶液冲洗30 s，无菌水冲洗2次，置于0.2%氯化汞溶液中浸泡30 min，无菌水冲洗6次，无菌滤纸吸干水。在无菌条件下将五色梅叶剪成小片，置于抗生素PDA培养基上，28 ℃培养箱中倒置培养 3～7 d，待真菌从组织块边缘长出后，挑取菌丝转接到PDA培养基进行纯化培养。反复转接纯化直到菌落形态一致，得到纯培养菌株YJ-11。PDA试管斜面接种、液体石蜡封存、 4 ℃冰箱保存。
1.2.2 内生真菌的形态观察与鉴定 从纯化培养数日的菌落上挑取菌丝并连同分生孢子制成玻片，置于光学显微镜下观察，对照资料[15]确定真菌的分类学地位。
1.2.3 内生真菌的液态培养 1 000 mL三角瓶每瓶装400 mL GYP培养基，1.25×105 Pa高压灭菌30 min，冷却至室温备用。从试管斜面挑取菌丝到PDA培养基上活化培养3～7 d，将活化后的菌丝接种到三角瓶中， 30 ℃摇瓶发酵培养14 d。
1.2.4 内生真菌粗提物的制备 液体培养完成后，取发酵产物用纱布过滤，得菌丝体和发酵培养液。菌丝体风干后用甲醇浸泡提取3次，每次24 h，合并甲醇提取液，50 ℃以下减压回收甲醇，得到菌丝体甲醇提取物A；发酵培养液用乙酸乙酯等体积萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，50 ℃以下减压回收乙酸乙酯，得到培养液乙酸乙酯提取物B。
1.2.5 内生真菌提取物体外抑菌活性测定 采用纸片琼脂扩散法[16]测定内生真菌yj-11粗提物对金黄色葡萄球菌的抑制作用。将提取物A和提取物B分别溶于二甲基亚砜中，配成浓度为50 mg/mL的药液备用。测定粗提物抑菌活性步骤如下：①制作金黄色葡萄球菌菌悬液。将金黄色葡萄球菌接种于LB液体培养基，室温下静置培养24 h，得菌悬液。②测定粗提物抑菌活性。在无菌条件下将金黄色葡萄球菌菌悬液均匀涂布于肉汤琼脂培养基平板上，将直径6 mm无菌药敏纸片贴于平板上，其中2片药敏纸片上分别加入100 μL含提取物A和B的二甲基亚砜药液。试验设阴性对照（仅加二甲基亚砜），阳性对照（加链霉素），3个重复。于35 ℃孵育24 h，测定抑菌圈直径。
2 结果与分析
通过分离培养得到一株纯的内生真菌YJ-11（图1），其菌落呈淡蓝色，气生菌丝为松絮状，分生孢子梗光滑，具横隔，顶端生有扫帚状分枝，初步鉴定为丝孢纲（Hyphomycetes）丝孢目（Hyphomycetales）青霉属（Penicillium sp.）。
2.2 内生真菌YJ-11体外抑菌活性
纸片琼脂扩散法测定结果表明，药敏纸片含5 mg提取物A和提取物B时，其周围产生明显的抑菌圈，抑菌圈直径分别为（38.5±3.3） mm和（15.0±5.0） mm。根据纸片扩散法抑菌结果判断标准[17]，确定内生真菌YJ-11菌丝体和发酵培养液提取物对受试细菌金黄色葡萄球菌具有显著的抑菌活性。该菌值得进一步研究开发。
3 结论
从广东药用植物五色梅叶中分离得到一株内生真菌YJ-11，鉴定属青霉属，体外抑菌试验结果表明，该内生真菌菌丝体甲醇提取物和发酵培养液乙酸乙酯提取物均能有效地抑制金黄色葡萄球菌。
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