微生物降解对人参自毒作用的缓解效应
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[摘要] 连作障碍问题严重制约人参生产及土地资源的合理利用，自毒作用是导致连作障碍的关键因子之一。在前期筛选到人参自毒物质降解菌的基础上，研究采用平板培养法和常规生理生化方法测定人参种子萌发的生物学指标和保护性酶活性，以探究自毒物质降解菌对人参自毒作用的缓解效果。研究发现，除棕榈酸外，自毒物质苯甲酸、邻苯二甲酸二异丁酯、丁二酸二异丁酯和2，2-（4-羟基苯基）丙烷降解液对人参种子生长的毒害作用得到显著缓解，与对照无显著差异。除苯甲酸外，其余自毒物质降解后人参SOD，POD，CAT酶活性均较降解前显著降低。研究结果表明，微生物降解是缓解自毒物质抑制人参种子萌发的有效途径，该发现将有助于人参连作障碍问题的解决。
[关键词] 人参；自毒物质；降解菌；种子萌发；酶活性
[收稿日期] 2013-12-23
[基金项目] 国家自然科学基金项目（81072992，81373911）
[通信作者] 丁万隆，Tel：（010）57833360，E-mail：；赵东岳，Tel：（010）57833360，E-mail：
[作者简介] 李勇，Tel：（010）57833360，E-mail：
人参Panax ginseng C. A. Mey.为五加科人参属药用植物，主产我国东北地区长白山麓。目前，市售人参主要依赖人工栽培，连作障碍是困扰人参规范化种植的最突出问题。据报道，自毒作用是造成人参连作障碍产生的主要根源之一[1]。深入研究发现，距离人参根系越近的土壤，甲醇提取物对人参种子萌发的抑制作用越强，新开垦的林地土则基本无抑制作用[2]。通过化学分析，进一步从人参栽培土壤中分离、鉴定了多种对人参种子萌发及生长具有明显抑制作用的化学成分，其中部分化合物是国际公认的化感物质[3-5]。本课题组从六年生人参根围土中筛选出5种能够高效降解人参自毒物质的细菌菌株，液体培养状态下均能以人工添加的自毒物质作为唯一碳源生长，在7 d内对自毒物质的降解率接近80%[6]。在此基础上，本文通过对人参种子胚根、胚轴生长情况以及SOD，POD，CAT酶活性的测试分析，进一步明确了微生物降解对人参自毒作用的缓解作用。本研究不仅有助于揭示自毒物质降解菌对人参自毒作用的缓解效果，同时也为降解菌在生产中的合理应用提供参考依据。
1 材料
经过后熟处理的人参种子购自吉林省抚松县万良镇。人参种子先用自来水冲洗干净，再用1 000倍多菌灵可湿性粉剂处理15 min，自来水反复冲洗多次，25 ℃恒温培养箱黑暗保湿培养2 d，选择出芽一致、颗粒饱满的人参种子开展自毒效应缓解研究。分别将自毒物质降解菌接种至LB液体培养基，37 ℃，120 r・min-1震荡培养24 h。取10 μL种子液接种至含100 g・L-1自毒物质的基础盐培养基中，37 ℃，120 r・min-1恒温震荡培养14 d，降解代谢液4 ℃冷藏，备用。
2 方法
2.1 自毒物质溶液的配制 苯甲酸（A）、邻苯二甲酸二异丁酯（B）、丁二酸二异丁酯（C）、棕榈酸（D）和2，2-（4-羟基苯基）丙烷（E）购自国药集团化学试剂北京有限公司。分别称取5 g自毒物质，溶于50 mL无水乙醇，配制成质量浓度为100 g・L-1的母液，备用。基础盐培养基包括：（NH4）2SO4 2 g，MgSO4・7H2O 0.35 g，CaCl2 0.1 g，K2HPO4 0.5 g，NaH2PO4 0.5 g，蒸馏水1 L，pH 7.0。分别将自毒物质降解菌的单菌落接种至LB液体培养基，37 ℃，120 r・min-1震荡培养24 h。取10 μL接种在含自毒物质（100 mg・L-1）的基础盐培养基中，37 ℃，120 r・min-1恒温震荡培养14 d，降解液4 ℃冷藏，备用。
2.2 生物学测定 分别将5 mL自毒物质降解液以及1 mg・L-1（低浓度），10 mg・L-1（中浓度），100 mg・L-1（高浓度，阳性对照）自毒物质的无机盐培养液加入底部含2层吸水滤纸的玻璃培养皿（Φ9 cm）中，均匀摆放10粒事先灭菌的人参种子，每种处理3次重复。以不加自毒物质的无机盐培养液作为阴性对照。将上述处理在培养箱中25 ℃恒温避光培养10 d，期间添加无菌水保湿[6]。测量种子胚根和胚轴长度，并计算抑制率（I），抑制率I=（处理-对照）/对照×100%。“+”表示抑制作用，“-”表示促进作用。
2.3 酶活性测定 取0.2 g人参幼苗，加入5 mL预先配好的磷酸缓冲液（pH 8.0），冰浴研磨，4 ℃，1万r・min-1离心15 min，收集上清液，用于酶活性测定。超氧化物歧化酶（SOD）酶活性测定采用邻苯三酚自氧化法[7]，过氧化物酶（POD）酶活性测定采用愈创木酚法[8]，过氧化氢酶（CAT）酶活性测定参考Barat[9]和王立华等[10]的方法。采用随机取样的方法，每个处理3次重复。
2.4 数据分析 用SPSS 12.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA）结合LSD法，对统计结果进行方差分析。
3 结果与分析
3.1 自毒物质代谢物对人参种子胚根生长的影响 根据人参种子胚根生长的分析结果（图1），对照组种子胚根长度平均值为22.73 mm。比较发现，中、低浓度的苯甲酸对胚根生长的抑制作用与对照无显著差异，高浓度苯甲酸（I=46.41%）与二者有极显著差异（P
3.2 自毒物质代谢物对人参种子胚轴生长的影响 根据人参种子胚轴生长数据统计结果（图2），对照组种子胚轴长度平均值为34.18 mm。苯甲酸对人参种子胚轴的抑制作用随浓度升高而增强，高浓度时对种子胚轴生长的抑制率（I=33.41%）较对照有显著增强（P
3.3 自毒物质代谢物对人参种子SOD酶活性的影响 苯甲酸对人参种子SOD酶活性有促进作用，且高浓度处理（I=-216.38%）与对照的差异达极显著水平（P
3.4 自毒物质代谢物对人参种子POD酶活性影响 苯甲酸对人参种子POD酶活性的促进作用与浓度正相关，中（I=-77.78%）、高（I=-128.41%）浓度处理与对照存在极显著差异（P
3.5 自毒物质代谢物对人参种子CAT酶活性影响 低浓度苯甲酸对人参种子CAT酶活性表现极显著促进作用（P
4 结论与讨论
自毒物质通过影响植物的生理代谢活动，抑制线粒体的电子传递或氧吸收，进而造成植物光合作用及生长、发育受阻，抗逆性下降。已有研究表明，降解菌能够有效降解环境土壤中的自毒活性物质，从而减缓其对植物造成的伤害。喻国辉等[11]从污泥中分离出苯丙烯酸、苯甲酸降解菌株，其对黄瓜生长的自毒作用有明显的缓解效应。高峰[12]、杜霄霞[13]、毛宁[14]、解灵军等[15]分别筛选出对草莓自毒物质苯甲酸、对羟基苯甲酸有降解能力的细菌和放线菌，对草莓连作障碍起到较好的缓解作用。杜国营[16]研究发现，黄孢原毛平革菌对黄瓜自毒物质香草酸、阿魏酸、对羟基苯甲酸均具有较好的降解能力。王晓辉[17]筛选出对西瓜自毒物质阿魏酸具有降解活性的放线菌株，能有效缓解阿魏酸对西瓜幼苗生长的毒害作用。本研究从老参地土壤中筛选出对5种人参自毒物质有较好降解活性的菌株，通过室内研究，证实了其对自毒作用的缓解效果；田间试验结果表明，接种降解菌能够明显提高人参幼苗的存苗率，且对人参根增重无不良影响。自毒作用是导致人参连作障碍的重要因素之一，人参自毒物质降解菌的分离，对缓解人参连作自毒效应以及产区老参地的修复及再利用具有十分重要的意义。
大量研究证实，由POD，SOD，CAT等组成的保护酶系统对维持植物细胞低水平自由基具有重要作用[18-19]。Fang等[20]研究发现，外源水杨酸能显著抑制稗草SOD，POD，CAT酶活性。林文雄等[21]研究发现，水稻叶片浸提液能显著抑制稗草SOD，CAT酶活性。本研究发现，5种自毒物质对人参3种保护性酶活性均有不同程度影响，经自毒物质降解菌处理后，人参种子酶活性均与低浓度处理或对照趋于接近，说明筛选出的降解菌能高效降解供试自毒物质，从而有效缓解人参的自毒作用。
[参考文献]
[1] 简在友， 王文全， 孟丽， 等. 人参属药用植物连作障碍研究进展[J]. 中国现代中药， 2008（10）：3.
[2] 李勇， 朱殿龙， 黄小芳，等. 不同土壤浸提物对人参种子生长抑制作用的初步研究[J]. 中草药， 2008， 39（7）：1070.
[3] 陈长宝， 王艳艳， 刘继永， 等. 人参根际土壤中化感物质鉴定[J]. 特产研究， 2006（2）：12.
[4] 黄小芳， 李勇， 丁万隆. 人参根系分泌物对种子萌发的自毒效应[J]. 种子， 2009， 28（10）：4.
[5] 李勇， 黄小芳， 丁万隆， 等. 不同土壤提取物对人参种子生长的化感效应及其化学成分[J].生态环境， 2008， 17（3）：1173.
[6] 赵东岳， 李勇， 丁万隆. 人参自毒物质降解细菌的筛选及其降解特性研究[J]. 中国中药杂志， 2013， 38（11）：1703.
[7] 张龙翔， 张庭芳， 李令媛. 生化实验方法和技术[M].北京：高等教育出版社， 1997：217.
[8] 王学奎. 植物生理生化实验原理和技术[M]. 北京：高等教育出版社， 2005：167.
[9] Barata R M， Chapparo A， Chabregas S M， et al. Targeting of the soybean leghemoglob in tobacco chloroplasts： effects on aerobic metabolism transgenic plants[J]. Plant Sci， 2000， 155：193.
[10] 王立华， 陈向东， 兰进， 等. LED光源的不同光质对灵芝菌丝体生长及抗氧化酶活性的影响[J]. 中国中药杂志， 2011， 36（18）：2471.
[11] 喻国辉， 谢银华， 陈燕红， 等. 利用微生物缓解苯丙烯酸对黄瓜生长的抑制[J]. 微生物学报， 2006， 46（6）：934.
[12] 高峰， 尹宝重， 扈金， 等. 以自毒物质高效降解菌B3512为功能菌的土壤添加物防治草莓连作障碍的研究[J]. 河北农业科学， 2009， 13（9）：20.
[13] 杜霄霞. 草莓酚酸类自毒物质降解菌筛选及对草莓防病促生作用研究[D].杨凌： 西北农林科技大学，2009.
[14] 毛宁. 草莓根泌酚酸类自毒物质放线菌降解研究[D].杨凌： 西北农林科技大学， 2010.
[15] 解灵军， 尹宝重， 高峰， 等. 草莓根系自毒物质降解菌的筛选及降解效果研究[J]. 河北农业大学学报， 2009， 32（4）：76.
[16] 杜国营. 黄瓜根系分泌物中化感物质的鉴定及其生物降解研究[D].郑州： 河南农业大学， 2006.
[17] 王晓辉. 西瓜自毒物质阿魏酸降解放线菌筛选及其降解效果研究[D].杨凌： 西北农林科技大学， 2011.
[18] 李键， 刘奕， 洪滔， 等. 2种化感成分对木麻黄幼苗小枝活性氧含量和保护酶活性的影响[J]. 植物资源与环境学报， 2013， 22（2） ： 30.
[19] 李巧峡， 李腾腾， 高加来， 等. 化感物质对白藜种子萌发及抗氧化物酶活性的影响[J]. 草地学报， 2012， 20（3）：559.
[20] Fang C X， Xiong J， Qiu L， et al. Analysis of gene expressions associated with increased allelopathy in rice （Oryza sativa L.） induced by exogenous salicylic acid [J]. Plant Growth Regul， 2009， 57：163.
[21] 林文雄， 何华勤， 郭玉春， 等. 水稻化感作用及其生理生化特性的研究[J]. 应用生态学报， 2001， 12（6）：871.
Mitigative effect of micribial degradation on autotoxicity of Panax ginseng
LI Yong， LONG Qi-liang， DING Wan-long， ZHAO Dong-yue
（1. Institute of Medical Plant Development， Chinese Academy of Medicinal Sciences and Peking Union College， Beijing 100193， China；
2. State Key of Laboratory of Dao-di Herbs， National Resource Centre of Chinese Materia Medica，
China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）
[Abstract] Continuously cropping obstacle restricts ginseng production and rational use of land resource severely， and autotoxicity is one of the most important factors. In our previous work， ginseng autotoxin degrading bacteria were isolated， in the present research， plate culturing method and traditional physiological and biochemical method were used to analyze biological indices and protective enzyme activities， in order to elucidate the mitigative effect of autotoxin degrading bacteria on autotoxicity of P. ginseng. Results indicated that， except for palmitic acid， autotoxicity of benzonic acid， diisobutyl phthalate， diisobutyl succinate， and 2，2-bis （4-hydroxyphenyl） propane on the growth of ginseng seeds was significantly alleviated after autotoxins degrading bacteria was inoculated， and which have no evident difference with control. Except for benzoic acid， enzyme activity of SOD， POD and CAT in other autotoxin degrading treatments decreased significantly. The present research showed that， microbial degradation could alleviate the autotoxicity of autotoxins on ginseng seeds effectively， and which will be helpful for the resolution of ginseng continuously cropping obstacle problem.
[Key words] Panax ginseng； autotoxins； degrading bacteria； seed germination； enzyme activity
doi：10.4268/cjcmm20141515