盐溶蛋白电泳技术及其在玉米种子鉴定中的应用

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摘要:盐溶蛋白电泳方法具有样品提取时间和电泳时间短、电泳谱带清晰、分辨率高、品种间谱带差异大、组合间互补带明显等优点,因而在玉米种子纯度鉴定中具有重要意义。文章综述了盐溶蛋白电泳技术检测玉米种子纯度的原理、操作要点、谱带分析及在电泳过程中常出现的问题及解决办法,旨在为从事种子鉴定的工作者提供参考。

关键词:盐溶蛋白;蛋白质电泳技术;种子纯度鉴定

中图分类号:S513 文献标识码:A 文章编号:1674-0432(2010)-07-0042-2

0 前言

随着新育种方法的广泛应用以及种子加工业对种子质量的特殊要求,传统的形态学检验方法已不能满足种子生产、运输和加工各个环节对检验的要求,迫切需要新的精确的检验手段的应用。上个世纪70年代以来,蛋白质电泳技术开始应用于种子品种鉴定和纯度检验,并得到迅速推广。1991年,国际种子检验协会把蛋白质电泳方法正式定为标准的品种鉴定方法,从而使蛋白质电泳技术在种子品种鉴定和纯度检验上占有重要地位,对防止伪劣种子流入市场同时保护优良种质防止良种退化,维护育种家们的知识产权和权益等方面具有重要意义。

随着电泳技术的迅速发展,玉米种子纯度盐溶蛋白质鉴定方法于2001年9月被列为行业标准,使得应用蛋白质电泳鉴定种子纯度的技术得到迅速普及。盐溶蛋白电泳方法具有样品提取时间和电泳时间短、电泳谱带清晰、分辨率高、品种间谱带差异大、组合间互补带明显等优点。

1 盐溶电泳技术的原理

从玉米种子中提取的盐溶蛋白在聚丙烯酰胺凝胶的浓缩效应、分子筛效应和电泳分离的电荷效应作用下进行分离,通过染色显示蛋白质谱带类型。不同玉米品种由于遗传组成的不同,种子内所含的蛋白质种类有差异,这种差异可利用电泳图谱加以鉴别,从而对种子真实性和品种纯度进行鉴定。

2 盐溶电泳技术的操作要点

2.1 样品制备

按GB/T3543.2的要求,从送验样品中随机分取玉米种子至少100粒,用单籽粒粉碎器粉碎,放人1.5ml离心管中,用滴管加入与样品体积相同的样品提取液,摇匀,放置5min后,再摇一次,30min后,用离心机离心(5000r/min)15min,取上清液用于电泳。

2.2 凝胶制备

2.2.1 胶室制备 将预先洗净晾干的玻璃板装入胶条中,然后把胶条固定在垂直板电泳槽内,保持水平,短板向正极,拧紧螺栓,备用。

2.2.2 封底缝 根据电泳槽大小,取适量分离胶溶液于烧杯中,用微量进样器加入适量3%的过氧化氢溶液(一般每5ml分离胶溶液加20μl3%过氧化氢溶液),迅速摇匀,并从长玻璃板外侧沿玻璃板倒入,振动电泳槽3次,放平。

2.2.3 灌分离胶 底缝封住后,用滤纸条插入两玻璃板之间,吸去因聚合而析出的水;量取分离胶溶液适量,加入3%过氧化氢溶液(一般每15ml分离胶溶液加3%过氧化氢20μl)迅速摇匀;倾斜电泳槽,将分离胶溶液倒人两玻璃板之间,高度距短玻璃板上沿1.2cm;放平电泳槽并在试验台上振动3次后,迅速加入适量的正丁醇封住胶面。待凝胶聚合后,吸出分离胶表面上的正丁醇,并用去离子水冲洗胶面3次,用滤纸吸干。

2.2.4 灌浓缩胶 量取浓缩胶溶液适量,加入3%过氧化氢溶液(一般每5ml浓缩胶溶液加3%过氧化氢溶液40ul),迅速搅匀,倒入两玻璃板之间,马上插好样品梳,样品梳底部距分离胶顶部0.5cm。

2.3 点样

浓缩胶聚合后,拔出样品梳并将样品槽清理干净,用微量进样器在每个样品槽中加入不同籽粒的样品上清液15ul,每点一粒后,都要用去离子水清洗进样器3次。

2.4 电泳

加样完毕后,倒人电极缓冲液,上槽电极缓冲液面要高于短玻璃板,下槽电极缓冲液面要高于铂金丝;将电源线正极接上槽,负极接下槽;接通电源,采用500V稳压进行电泳,待甲基绿指示剂下移至胶底部边缘时,关闭电源。

倒出电极液,从电泳槽内取出胶室,卸下胶条,启开玻璃板,取出胶片,浸入染色液中。

2.5 染色

在30℃恒温条件下染色2-4h。之后取出胶片,用0.5%的不加酶洗衣粉水洗净。

2.6 结果计算

2.6.1 电泳测定值计算 待整个供检样品电泳结束后,在观片灯上鉴定胶片上电泳谱带的特征和一致性,计数供检样品粒数和非本品种粒数,并按公式[X(%)=100×(供检样品-非本品种颗粒)/供检样品粒数]计算电泳测定值X。

2.6.2 样品纯度值计算 将电泳测定值X代人公式Y=52.9+0.461X,计算出样品纯度值Y,再将Y与GB4404.1中的纯度值进行比较,判定样品是否合格。

3.盐溶蛋白质电泳常见谱带分析法

3.1 根据谱带特征、血缘关系和鉴定方法分类

可将谱带分为公共带和特征带两类。杂交种中均有公共谱带,这些谱带由于起源进化的历史和生态条件相同,具有数目不等的相同的谱带,在鉴定工作中,可以不检查鉴定这些谱带。不同品种的特征谱带具有重复性高,明确可靠的特征,所以只要检查鉴别这些谱带就可以鉴别品种。

3.2 按交杂种的谱带特征可将电泳谱带分为以下几类

3.2.1 互补型谱带 杂交种具有来自母本谱带和父本谱带的一种谱带类型,多数杂交种都呈此类型,也是杂交种中最常见的。互补带呈多种形式表现,不同的杂交种互补带有呈现一对、两对或者三四对的;另外,来自父母本的两条互补带间距也不同,有较宽和较窄的。

3.2.2 杂交型谱带 杂交种所具有而其父母本没有的谱带类型,只有杂交种才具有的新产生的谱带。

3.2.3 偏亲型谱带 杂交种谱带与双亲中的一种谱带相同,即同于母本谱带型称偏母型,同于父本谱带称为偏父型,这种类型的杂交种出现较少。

3.2.4 新型谱带 这种类型在观察同一品种不同籽粒的谱带时偶尔发现有一粒或几粒表现出其它杂交种不具有的一条谱带,而其它谱带相同,这种情况应判断为杂交种。

3.2.5 缺带型谱带 在谱带观察时通常会发现有一粒或几粒杂交种丢失的一条谱带,而其它标志谱带相同,这可能由于杂交不完全造成的。

3.2.6 正反交杂交种谱带 通过试验表明,正反交杂交种谱带时完全相同的,因为它们来自相同的亲本,遗传基础相同,因此谱带表现形式一致。

3.2.7 谱带的着色程度 在谱带观察中,还可以借助同一胶版上父母本及其杂交种谱带着色程度不同进行对比判断。一般杂交种着色较深,双亲谱带着色较浅,这在判断是否为自交系时可作为辅助参考。

4 盐溶电泳常出现问题及解决办法

4.1 浓缩胶或分离胶聚合缓慢或不聚合

4.1.1 产生原因

(1)试剂不纯。按照《玉米种子纯度盐溶蛋白质电泳鉴定方法》(NY/T449-2001)规定,盐溶蛋白质电泳所需药品应为分析纯试剂,如果用化学纯代替,易产生凝胶不聚合的现象。

(2)在试剂配制过程时各种试剂的用量不准确。在配制浓缩胶时,应严格按照NY/T449-2001规定的比例配制,否则容易造成凝胶不聚合的现象。

(3)胶液过期。由于浓缩胶、分离胶溶液中的硫酸亚铁、抗环血酸等物质不稳定,易氧化分解变质,因此应将分离胶和浓缩胶贮液贮存在棕色瓶内,同时低温保存。

(4)催化剂失效。盐溶蛋白质电泳中使丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺聚合的催化剂是过氧化氢溶液,其化学性质极不稳定,遇光、热、重金属和其它杂质易分解,导致凝胶不聚合。

4.1.2 解决办法

(1)在配制溶液时,应使用分析纯试剂。

(2)按照NY/T449-2001规定,按比例配制。

(3)应控制试剂配制数量,最好是即配即用;此外还需注意试剂低温保存。

4.2 灌胶室时出现漏胶现象

4.2.1 产生原因

(1)封底不严。在封底时如果胶条上带有水滴、气泡或者灌胶量不足,底缝封不严就容易漏胶。

(2)胶条两侧有缝隙。底缝好后,但还是出现漏胶,可能是因为胶条硬度大或者固定玻璃板的螺丝没有拧紧,使玻璃板与胶条两侧间留有缝隙,胶液从两侧漏掉。

4.2.2 解决办法

(1)在封底前用滤纸擦干玻璃板及胶条上的水分,倾斜电泳槽,将足够量的分离胶沿长玻璃板外侧倒入,左右晃动一下,使胶液均匀分布于底部,不留空隙。

(2)在灌底胶时,放胶的速度要慢一些,避免产生气泡。

4.3 样槽制作不理想

4.3.1 产生原因

(3)在插入样梳时,插入速度太快可使样孔底部产生气泡。

(2)在拔出样梳时,用力不均匀使样孔撕破。

(3)在制作样槽时浓缩胶的灌入量是关键因素。如果灌入浓缩胶的量不足,制成的样槽低于短玻璃板,点样时样品容易漂流到旁边的样槽,造成样品混合;如果灌入浓缩胶的量过多时,多余的凝胶液凝固后沉积在样孔处封住点样孔,不利于点样。

4.3.2 解决办法

(1)插入样梳时小心,垂直插入,拔样梳时,应当用力均匀,缓慢拔出样梳,以免撕裂样孔。

(2)控制好浓缩胶的灌入量,量的多少应视样品梳的薄厚决定,一般灌入的胶面应低于短玻璃板,在样梳插入后胶面与短玻璃板的顶端刚好齐平。

4.4 出现谱带不正常

4.4.1 谱带出现拖尾现象

(1)产生原因:主要是样品溶解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。

(2)解决办法:①如果是由于样品溶解效果不佳引起的需要在加样前离心或加适量样品促溶剂;②电泳缓冲液使用时间长了,需要重新配制;③凝胶聚合不充分,需要延长凝胶聚合时间以使凝胶充分聚合。

4.4.2 谱带出现弯曲

(1)产生原因:①当凝胶的中间部分凝固不均匀,谱带出现两边翘起中间凹下现象,多出现于较厚的凝胶中;②谱带出现两边向下中间鼓起的现象,一般是由于两板之间的底部间隙气泡未排除干净。

(2)解决办法:①如果谱带出现两边翘起中间凹下现象,需等凝胶充分凝固再作后续实验;②谱带出现两边向下中间鼓起的现象,可在两板间加入适量缓冲液,以排除气泡。

4.5 已染色的蛋白质谱带又褪色

4.5.1 产生原因

(1)染色液多次利用。染色液多次重复利用和长期放置,水分蒸发,其中三氯乙酸浓度增大,溶解了已与蛋白质形成的染料――蛋白复合物的考马斯亮蓝。

(2)染色剂试剂着色效果不是很好。

4.5.2 解决办法 固定与染色分离。分别配制三氯乙酸和考马斯亮蓝溶液。将蛋白质谱带首先在三氯乙酸固定液中固定30min以上,再放在清水盘内加几滴考马斯亮蓝溶液染色。这样既可以是染色液和固定液多次重复利用,又保证了染色效果。

4.6 电泳时间延长

4.6.1 产生原因

(1)多次重复使用电极缓冲液。多次使用电极缓冲液后pH值发生了变化,pH值与被分离蛋白质的等电点差异变小,蛋白质分离速度变慢。

(2)配制缓冲的蒸馏水不新鲜。蒸馏水被污染后,电极缓冲液的离子强度太高,减慢了电泳中蛋白质的分离速度。

4.6.2 解决办法

(1)电极缓冲液最好不要重复使用。如重复使用,可在使用前应测定pH值,通过加入适量的乳酸将其调整到标准要求。

(2)用新鲜的蒸馏水,最好用重蒸水配制电极缓冲液。

4.7 前沿指示剂向相反方向移动

4.7.1 产生原因 电泳时前沿指示剂甲基绿不是沿电泳槽向下移动,而是向上移动,几分钟后彻底从槽中消失了,这是由于把电源的正负极接错造成的。

4.7.2 解决办法 盐溶蛋白质电泳是在酸性条件下进行的,蛋白质带正电荷,向负极移动,连接电源线时应注意短玻璃板接正极,长玻璃板接负极。

参考文献

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作者简介:肖海峻(1966-),女,北京农业职业学院食品与生物工程系副教授,博士,研究方向:植物资源的开发与利用。