杂交中稻广两优476品种与纯度的鉴定

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摘要：为辨别杂交中稻广两优４７６种子真伪并鉴定其纯度，利用农业部《水稻品种鉴定 DNA指纹方法》（ＮＹ／Ｔ １４３３―２００７）中推荐的２４对引物进行PCR，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳对广两优４７６及其亲本，以及另外几个育种常用亲本材料进行了多态性筛选，并利用筛选所得引物的SSR标记对广两优４７６进行了种子纯度分析。结果表明，这２４对引物在几个常用亲本及广两优４７６间具有良好的多态性，可用于构建广两优４７６的ＤＮＡ指纹图谱。同时，从中筛选得到标记ＲＭ２０９和ＲＭ１７的两对引物在广两优４７６父母本间有显著多态性，其中ＲＭ２０９的引物的PCR产物在２％琼脂糖凝胶电泳条件下分辨效果最好，可用于广两优４７６杂交种子的纯度鉴定。２００９年冬在实验室使用ＲＭ２０９鉴定广两优４７６杂交种子纯度，结果为９８．６％，与２０１０年春在海南田间种植鉴定纯度９８．３％相符。

关键词：ＳＳＲ标记；杂交水稻；广两优４７６；品种鉴定；纯度鉴定

中图分类号：Ｓ５１１．３＋２；Ｓ３３９．３＋１ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）06－1254-03

The Variety and Purity Indentification of Hybrid Rice Guangliangyou 476

ＤＵ Ｘｕｅ－ｓｈｕ，ＱＩ Ｈｕａ－ｘｉｏｎｇ，ＸＩＡ Ｍｉｎｇ－ｙｕａｎ

（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｃｒｏｐｓ， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｕｈａｎ ４３００６４，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： ２４ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ ｂｙ Ｃｈｉｎａ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｉｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ； ａｎｄ ｔｈｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｓｈｏｗｉｎｇ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｍｏｎｇ ｈｙｂｒｉｄ ｒｉｃｅ ｐａｒｅｎｔｓ ｏｆ Ｇｕａｎｇｌｉａｎｇｙｏｕ ４７６ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｐｏｐｕｌａｒ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｐｕｒｉｔｙ ｔｅｓｔ ｏｆ Ｇｕａｎｇｌｉａｎｇｙｏｕ ４７６ ｓｅｅｄｓ． Ｉｔ ｗａｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｗｅｒｅ ｗｉｔｈ ｇｒｅａｔ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｐａｒｅｎｔｓ ａｎｄ Ｇｕａｎｇｌｉａｎｇｙｏｕ ４７６， ｔｈｕｓ ｗｅｒｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｏｆ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｏｆ Ｇｕａｎｇｌｉａｎｇｙｏｕ ４７６． ２ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ， ＲＭ２０９ ａｎｄ ＲＭ１７， ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｒ４７６ ａｎｄ Ｇｕａｎｇｚｈａｎ６３Ｓ； ｍｏｒｅｏｖｅｒ， ｂａｎｄｓ ｏｆ ＲＭ２０９ ｗｅｒｅ ｗｅｌｌ ｄｅｐａｒｔｅｄ ｂｙ ２％ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ｍａｋｉｎｇ ｉｔ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｔｅｓｔ ｏｆ Ｇｕａｎｇｌｉａｎｇｙｏｕ ４７６ ｓｅｅｄｓ． Ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｅｓｔｅｄ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ Ｇｕａｎｇｌｉａｎｇｙｏｕ ４７６ ｈｙｂｒｉｄ ｓｅｅｄ ｉｎ ｗｉｎｔｅｒ ２００９ ｕｓｉｎｇ ＲＭ２０９ ｗａｓ ９８．６％， which was ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｆｉｌｅｄ ｔｅｓｔｅｄ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎ Ｈａｉｎａｎ ｓｐｒｉｎｇ ２０１０（９８．３％）．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒ； ｈｙｂｒｉｄ ｒｉｃｅ； Ｇｕａｎｇｌｉａｎｇｙｏｕ ４７６； variety identification； ｐｕｒｉｔｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ

获得高纯度的水稻杂交种子是充分发挥杂交稻杂种优势潜力的基础。由于在制种过程中往往出现生物混杂、机械混杂等，导致杂交种子的纯度和真实性受到影响，因此在水稻杂交种子销售使用前，需对其纯度和真实性进行鉴定［１］。当前鉴定种子纯度的方法主要是田间形态鉴定法，此外还有种子形态鉴定法、幼苗鉴定法、叶色标记鉴定法、同工酶电泳法、蛋白质电泳法以及近年来逐渐开始应用的水稻ＤＮＡ指纹图谱鉴定技术等［２］。上述鉴定方法各有利弊。田间形态鉴定法结果较可靠，但存在鉴定周期长、费用高，受季节限制，且鉴定结果是否可靠与鉴定人员经验丰富与否相关；种子形态鉴定法、幼苗鉴定法、叶色标记鉴定法则受限于检测对象是否具备典型的特异性状，适用范围有限；同工酶电泳法、蛋白质电泳法主要的问题是鉴定结果可靠程度不高；而ＤＮＡ指纹图谱技术，主要是指利用包括ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ、ＡＦＬＰ和ＳＳＲ等分子标记技术，鉴定生物个体间是否存在内在的差异［３］，因而鉴定结果可靠，其中ＳＳＲ为共显性标记，具有多态性丰富、简便快捷、稳定性好等特点，且鉴定时间短，费用适中，不受环境影响等，相比较而言更适用于种子真伪和纯度鉴定［４］。

广两优４７６是湖北省农业科学院粮食作物研究所以广占６３Ｓ为母本，以自主选育的抗白叶枯病和褐飞虱双抗恢复系Ｒ４７６为父本选育的高产、优质、多抗两系杂交中稻品种，于２０１０年通过湖北省农作物品种审定委员会审定，审定编号２０１０００４。本研究拟通过筛选农业部颁布的行业标准《水稻品种鉴定 DNA指纹方法》（ＮＹ／Ｔ １４３３―２００７）中推荐的２４个ＳＳＲ标记，得到广两优４７６的指纹图谱及适合用于杂交种纯度鉴定的标记。

１ 材料与方法

１．１ 材料

武育粳３号、黄华占、Ｒ８３８、Ⅱ－３２Ｂ、扬稻６号、广占６３Ｓ、Ｒ４７６、广两优４７６以及ＩＲＢＢ２１、Ｂ５。含抗白叶枯病基因Ｘａ２１品系ＩＲＢＢ２１来自国际水稻研究所，抗褐飞虱基因Ｂｐｈ１４和Ｂｐｈ１５品系Ｂ５由武汉大学何光存教授提供，其他材料来自湖北省农业科学院粮食作物研究所分子育种课题组。

１．２ 方法

１．２．１ 水稻ＤＮＡ的提取 将种子置于发芽盒内发芽，芽长３ ｃｍ左右时剪取叶片，参照李进波等［５］改良的ＣＴＡＢ法提取ＤＮＡ。

１．２．２ ＰＣＲ反应体系 ＰＣＲ反应体系为１５ μＬ，含有１０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．３），５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ，１．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２，ｄＮＴＰｓ各０．２ ｍｍｏｌ／Ｌ，１０ ｎｇ左右的ＤＮＡ模板，引物各０．２ μｍｏｌ／Ｌ，Ｔａｑ酶１ Ｕ。反应程序为：９４ ℃预变性５ ｍｉｎ；９４ ℃、３０ ｓ，55 ℃、３０ ｓ，７２ ℃、１ ｍｉｎ，35个循环；７２ ℃延伸５ ｍｉｎ，４ ℃保存。反应在ＡＢＩ公司９７００热循环仪中进行。所有试剂均购自宝生物工程（大连）有限公司。

１．２．３ PCR产物的检测 PCR产物使用６％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，具体方法为取混合有染料指示剂的扩增产物２ μＬ加样于６％的非变性聚丙烯酰胺凝胶中，以１×ＴＢＥ作电泳缓冲液，３００ Ｖ恒压电泳，电泳在双板夹芯式电泳槽（北京六一仪器厂）上进行，根据染料指示剂的位置终止电泳。电泳后快速银染，结果拍照保存。银染显色参照Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ等［６］的方法略作改进，方法如下：凝胶经去离子水漂洗２次后在１ g/L ＡｇＮＯ３中染色５～１０ ｍｉｎ，去离子水漂洗２次后，在15 g/L ＮａＯＨ＋5 mL/L甲醛中显色，最后用去离子水漂洗１次。对于筛选得到的在双亲之间差异较大的PCR产物，改用２％琼脂糖凝胶电泳检测。

２ 结果与分析

２．１ DNA指纹图谱的构建

对当前育种工作中常用的７个亲本材料使用２４对引物进行ＰＣＲ扩增，均可以扩增出稳定的条带（表1）。其中标记ＲＭ２０８、ＲＭ２７３、ＲＭ３３６和ＲＭ７２的引物在不同亲本间扩增出的带型最少，为２种；标记ＲＭ２２４的引物扩增出的带型最多，为６种。可以看出这２４对引物较好地表现出了亲本材料的遗传多样性。

２．２ ＳＳＲ标记的筛选结果

使用农业部ＮＹ／Ｔ １４３３―２００７推荐的２４对引物对Ｒ４７６、广占６３Ｓ、广两优４７６和其他育种常用亲本进行了ＰＣＲ扩增。PCR产物使用６％非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，发现标记ＲＭ２０９和ＲＭ１７的引物在广两优４７６中扩增出的条带都涵盖了父本R476和母本广占63S扩增的条带（图１、图２）。

２．３ 引物的PCR产物在琼脂糖凝胶中的电泳结果

为降低试验成本、缩短试验时间，对筛选所得引物的PCR产物使用２％琼脂糖凝胶进行电泳。其中ＲＭ２０９的引物扩增出的杂种片段较为清晰，亲本两条带型较为明显，可适用于实际杂交种纯度的检测和鉴定（图３）。图3中第７泳道带型表示杂交种中混杂了父本种子。

２．４ 广两优４７６及含有相同抗病基因株系抗病基因的ＰＣＲ结果

从图4与图5可以看出，含有抗白叶枯病基因Ｘａ２１的两个亲本ＩＲＢＢ２１和Ｒ４７６带型相同，含有抗褐飞虱基因Ｂｐｈ１４的两个亲本Ｂ５和Ｒ４７６带型相同。

２．５ ＳＳＲ标记在广两优４７６杂种纯度鉴定的实际应用

２００９年冬，对武汉华泰种业有限公司生产的广两优４７６杂交种子，抽取５份样品，每份取２００粒种子，使用ＳＳＲ标记ＲＭ２０９进行纯度鉴定，鉴定结果是其纯度为９８．６％。余下种子同时在海南冬播进行田间纯度鉴定，２０１０年春鉴定结果为９８．３％，结果基本相符，证明该标记的分子生物学鉴定结果准确可靠。

３ 小结与讨论

当前分子标记技术在杂交种子纯度鉴定上的应用越来越多。对于含有抗性或其他优良基因的品种，通常使用检测该基因的共显性标记来检测其杂交种子的纯度。若电泳图谱显示出杂合带型则说明杂交种子是真实的。该方法的好处在于不需要大批量筛选引物，减少了工作量。但随着各种抗性或其他优良基因在育种实践中的广泛应用，越来越多的不同亲本含有相同的优良基因。同时商业制种基地大多集中分布，在实际生产过程中可能会有含相同优良基因的不同亲本串粉，这样通过检测单一优良基因的基因型就无法辨别串粉所造成的伪杂交种。而水稻ＤＮＡ指纹图谱技术在种子鉴定上的优点是标记数量多，涵盖整个基因组，反映的是品种间的内在差异，避免了鉴别单一抗性或其他优良基因的基因型无法鉴别上述杂交种子真伪的可能性。因此，鉴定结果更准确可靠。本研究通过构建广两优４７６的DNA指纹图谱，并筛选出了适合进行纯度分析的标记，既为今后广两优４７６杂交种子纯度的鉴定奠定了基础，同时也为其他杂交稻品种的鉴定提供了借鉴。

ＳＳＲ标记鉴定杂交种子纯度要求简便、快捷、成本低。本研究筛选所得ＳＳＲ标记ＲＭ２０９的引物的PCR扩增产物可用琼脂糖凝胶电泳检测，电泳２０～３０ ｍｉｎ即可得到结果，且琼脂糖可以重复使用，不会造成样品间干扰，降低了试验成本。此外，张凤娟等［７］，王伟威等［８］和陈罡等［９］对植物ＤＮＡ的快速提取方法进行了改进和优化，相对传统ＣＴＡＢ法而言，虽然提取的ＤＮＡ质量有所下降，但提取时间大大缩短，由数十小时缩短为仅２．５ ｍｉｎ，且不影响与多态性引物的结合及扩增［１０］。上述快速ＤＮＡ提取法结合本研究中采用的分子标记检测方法可以大大降低试验成本，提高试验效率。

根据ＧＢ／Ｔ ３５４３．５―１９９５农作物种子检测规程对聚丙烯酰胺电泳法测定大麦、小麦种子纯度的规定，一般每个样品测定１００粒种子，但在两系杂交稻种子纯度的分子检测方面还没有相关规定。彭锁堂等［１１］用ＳＳＲ标记对杂交稻组合籼优６３和两优培九分别用１００粒种子进行纯度鉴定，检测结果与田间鉴定结果非常接近。苏顺宗等［１２］利用ＳＳＲ标记对１２个杂交稻组合进行分子标记纯度检测，设３个重复，每个重复检测２００粒种子，鉴定结果经过数学统计分析后认为重复性较好，没有显著差异。说明对杂交种子进行纯度鉴定，每份样品抽样２００粒已具有一定的代表性，每份样品检测２００粒种子，结果已比较可靠。

参考文献：

［１］ 汪爱顺，李进波，刘汉珍． ＤＮＡ指纹用于杂交水稻种子纯度和真伪鉴定的研究进展［Ｊ］．分子植物育种，２００５，３（３）：３９３－４００．

［２］ 郑成超，温孚江． ＤＮＡ分子标记技术与作物品种纯度鉴定［Ｊ］．山东农业大学学报（自然科学版），１９９７，２８（４）：４９９－５０５．

［３］ 彭锁堂． 中国主要杂交水稻品种指纹图谱标记和鉴定技术的研究［Ｄ］． 杭州：浙江大学，２００２．

［４］ 方宣钧，刘思恒，江树业． 品种纯度和真伪的ＤＮＡ分子标记鉴定及其应用［Ｊ］．农业生物技术学报，２０００，９（２）：１０６－１１０．

［５］ 李进波，夏明元，戚华雄，等．水稻抗褐飞虱基因Ｂｐｈ１４和Ｂｐｈ１５的分子标记辅助选择［Ｊ］．中国农业科学，２００６，３９（１０）：２１３２－２１３７．

［６］ ＳＡＮＧＵＩＮＥＴＴＩ Ｃ， ＮＥＴＯ Ｅ， ＳＩＭＰＳＯＮ Ａ Ｊ Ｇ． Ｒａｐｉｄ ｓｉｌｖｅｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｏｎ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９４，１７（５）：９１４－９１９．

［７］ 张凤娟，张满良，朱水芳，等． 一种改进的水稻总ＤＮＡ的快速提取方法［Ｊ］．植物检疫，２００４，１８（６）：３３０－３３２．

［８］ 王伟威，孟庆虹，张瑞英，等． ５种主要农作物ＤＮＡ快速提取方法研究［Ｊ］．黑龙江农业科学，２００８（５）：１－２．

［９］ 陈 罡，钟 鸣，徐正进，等． 一种水稻幼苗单株ＤＮＡ的快速提取及ＰＡＧＥ银染改良法［Ｊ］．生物技术通讯，２００６，１７（２）：２１３－２１５．

［１０］ 李稳香，詹庆才． 杂交水稻种子纯度ＳＳＲ指纹图谱标记鉴定技术研究［Ｊ］．中国种业，２００６（３）：２１－２２．

［１１］ 彭锁堂，严启传，王学德，等． 水稻单粒种子ＤＮＡ提取及ＲＡＰＤ 程序优化研究［Ｊ］． 上海交通大学学报（农业科学版）， ２００２， ２０（１）：３４－３７．

［１２］ 苏顺宗，黄玉碧，杨俊品，等．利用ＳＳＲ鉴定水稻杂交种子纯度的研究［Ｊ］．种子，２００３（１）：２３－２５．