实验性脑出血后大鼠神经细胞凋亡与NF-κB的表达

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[摘要] 目的:研究实验性脑出血后大鼠神经细胞凋亡与nf-κB表达的动态变化,并初步探讨两者的关系。方法:将大鼠随机分为脑出血组、假手术组和对照组,应用立体定向技术将自体不凝血注入大鼠尾状核制备脑出血模型,大鼠分别在不同时间点断头取脑,连续冠状切片做TUNEL染色和NF-κB免疫组化染色。结果:凋亡细胞在脑出血后6 h出现,1 d后开始增多,3 d达到高峰,并持续到7 d仍有表达,并且与NF-κB的表达变化一致,各组与对照组比较,差异有统计学意义(P

[关键词] 大鼠;脑出血;凋亡;NF-κB

[中图分类号] R-33[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2010)02(b)-018-03

Apoptosis of neurocytes and expression of NF-κB in rat brain after experimental intracerebral hemorrhage

WU Dan, TENG Weiyu*

(Department of Neurology, the First Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, China)

[Abstract] Objective: To study the dynamic change of the apoptosis of neurocytes and the expression of NF-κB after experimental intracerebral hemorrhage (ICH) in rats and investigate the relationship between them. Methods: The rats were randomly divided into ICH group, sham group and control group. ICH rat models were prepared with stereotactic infusion of autologous blood into caudate nucleus. The brains of rats were gotten off at different times and successive coronal slice was made and then stained. The apoptosis of neurocytes and the expression of NF-κB were detected respectively by TUNEL and immunohistochemistry staining. Results: Apoptosis cells appeared at 6 h after ICH, significantly increased after 1 d, reached peak at 3 d and continued to 7 d, and showed significant difference compared with control group (P

[Key words] Rats; Intracerebral hemorrhage (ICH); Apoptosis; NF-κB

脑出血是神经系统常见病,出血后继发性损害导致的神经细胞死亡具有重要临床意义,细胞凋亡(apoptosis)作为一种基因调控的细胞死亡方式可能为其中的一个重要环节。陈吉相等[1]研究发现,假手术组偶见凋亡细胞,表明正常脑组织一般不发生细胞凋亡;脑出血后凋亡细胞数明显增多,据此认为,细胞凋亡是脑出血周围组织损伤的一个标志,在一定程度上反映了其受损伤的程度。核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)是一种广泛存在、功能多样的核转录因子,参与多种炎症相关基因的表达和调控[2]。近年来的研究显示,NF-κB在中枢神经系统中广泛存在,可见于大脑皮质、海马和小脑突触,神经元、神经胶质细胞与血管内皮细胞中均有表达[3]。目前关于脑出血后血肿周围组织NF-κB表达的研究甚少。本实验应用立体定向技术,将自体不凝血注入大鼠尾状核制备脑出血模型,用TUNEL染色观察神经细胞凋亡,用免疫组化染色观察NF-κB的表达,并初步探讨脑出血后神经细胞凋亡与NF-κB表达的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组

健康雄性SD大鼠45只,体重250～300 g,由中国医科大学实验动物中心提供。将大鼠随机分为脑出血组和假手术组,分别按6 h、1 d、3 d、7 d分为4个亚组,每组5只;另设对照组5只。

1.1.2 试剂与器材

NF-κB/p65兔抗鼠多克隆抗体、即用型SABC免疫组化试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司;动物头颅立体定位仪(SN-2,NARISHIGHE,日本);微量注射器(上海激光医学仪器厂);电子分析天平(BP211D,赛多利斯,德国);OLYMPUS光学显微镜(日本);图像分析仪(Metamorph Image System V4.6 VIC,美国);紫外分光光度仪(UV300,Spestronic Unicam,美国)。

1.2 方法

1.2.1大鼠脑出血模型的制作

将大鼠用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后,用微量注射器从大鼠右侧股动脉抽取70 μl血。在立体定位仪引导下将50 μl血缓慢注入右侧尾状核(前囟前0.2 mm,中线右旁3.0 mm处),进针6 mm,留针10 min后退针。假手术组注入50 μl生理盐水,其他操作同实验组。对照组不给予任何处置。术后观察大鼠的行为改变,给水、给食饲养。根据实验计划在不同时间点将大鼠断头取脑。

1.2.2 标本的采集及检测

在各时间点前15 min用过量水合氯醛麻醉大鼠后,开胸经左心室插管至主动脉(0.5 min内),依次灌注生理盐水100 ml及4℃ 4%多聚甲醛溶液250 ml,断头取脑,固定于4%多聚甲醛溶液中持续12～24 h,然后进行酒精脱水,二甲苯透明,浸蜡,包埋。

1.2.2.1 常规HE染色切片常规脱蜡、水化,依次经苏木素染色、1%盐酸酒精分化、返蓝以及伊红染色后进行脱水、透明、封片。光镜下观察,胞质为红色,胞核为蓝色。

1.2.2.2 TUNEL染色以TUNEL法检测凋亡细胞。切片常规脱蜡、水化,滴加脱氧核糖核酸转移酶(TDT)和地高辛标记的dUTP反应液,37℃孵育120 min;滴加生物素化抗地高辛抗体,37℃孵育30 min后DAB显色,苏木素复染,脱水、透明、封片。

1.2.2.3 NF-κB/p65免疫组化染色用免疫组化SABC法检测NF-κB/p65蛋白的表达。切片常规脱蜡、水化后行抗原热修复,滴加50 μl兔抗鼠多克隆NF-κB/p65抗体(1∶200),4℃过夜;然后滴加生物素化山羊抗兔IgG,室温20 min;滴加SABC,室温20 min。DAB显色,苏木素复染,脱水,透明,封片。

1.3统计学处理

在400倍光镜下观察并随机选择血肿周围5个不重复视野,计算阳性细胞积分光密度。所有数据以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS 13.0软件进行数据分析,采用t检验及Pearson相关分析,P

2 结果

2.1 HE染色

脑出血后6 h可见轻度脑水肿,血肿内红细胞形态完整。1 d可见脑水肿明显,血肿周围可见中性粒细胞及淋巴细胞浸润,胶质细胞开始增生。3 d时脑水肿最重,大量炎症细胞浸润,胶质细胞增生明显,大量神经元变性坏死。7 d时血肿有所吸收,血肿周围组织疏松,胶质细胞及血管增生明显。假手术组及对照组无明显病理改变。见图1。

图1 脑出血后不同时间点HE染色(×400)

(A.脑出血后6 h;B.脑出血后1 d;C.脑出血后3 d;D.脑出血后7 d)

2.2 TUNEL染色

TUNEL染色阳性细胞是凋亡细胞,表现为核周染色质浓缩的点状深染棕褐色细胞。凋亡细胞在脑出血后6 h出现,1 d明显增多,3 d达到高峰,此后逐渐减少,持续到7 d,与对照组比较,差异有统计学意义(P

表1 脑出血后不同时间点TUNEL阳性细胞表达

(x±s,积分光密度/HP)

与对照组比较,*P

图2 脑出血后不同时间点TUNEL阳性细胞的表达(×400)

(A.脑出血后6 h;B.脑出血后1 d;C.脑出血后3 d;D.脑出血后7 d)

2.3 NF-κB/p65免疫组化染色

脑出血周围组织NF-κB/p65阳性细胞于术后6 h开始出现,1 d后逐渐增多,3 d达高峰,此后逐渐减少,持续到7 d仍高于对照组(P

表2 脑出血后NF-κB/p65蛋白表达(x±s,积分光密度/HP)

与对照组比较,*P

图3 脑出血后不同时间点NF-κB/p65阳性细胞的表达(×400)

(A.脑出血后6 h;B.脑出血后1 d;C.脑出血后3 d;D.脑出血后7 d)

2.4脑出血后神经细胞凋亡与NF-κB/p65表达的相关性分析

脑出血后TUNEL表达与NF-κB/p65表达呈正相关(r=0.957,P

3讨论

凋亡即程序性死亡,是在中枢神经系统涉及正常发育、再生、增殖和病理变性的细胞死亡的主要方式[4]。已有研究发现,在缺血性脑组织的不同部位可见到神经细胞凋亡[5-6]。本实验结果显示,凋亡细胞在脑出血后6 h出现,3 d达高峰,7 d时仍有少量表达,提示脑出血后存在细胞凋亡且呈动态性变化,据此推断细胞凋亡是脑出血周围组织损伤的一个重要标志。

NF-κB是一种广泛存在、功能多样的核转录因子,它在免疫、炎症、细胞生长、分化、凋亡、癌变和个体发育等方面发挥着多种重要的生物学功能[7]。它由ReIA(p65)和p50 2个亚基以二聚体形式组成,仅p65含有激活转录的处理区[8]。已有研究证实,脑出血早期即有NF-κB表达,参与脑出血周围组织继发性损伤及脑水肿形成[9]。刘兵荣等[10]也研究发现NF-κB与脑出血后脑水肿有关。本实验结果显示,NF-κB/p65免疫组化阳性细胞于脑出血后6 h开始增多,1 d继续上升,3 d达高峰,此后逐渐下降,持续到7 d仍高于对照组,并且NF-κB与TUNEL阳性细胞的表达变化呈正相关,这与刘宗超等[11]的实验结果基本一致。大量研究证实,NF-κB具有促进中枢神经系统神经细胞凋亡的作用,在创伤、脑缺血、阿尔茨海默病及帕金森病的神经凋亡细胞内可以观察到NF-κB的激活[12-13]。由此推断,NF-κB的激活可能是导致脑出血后神经细胞凋亡的一个重要原因。

综上所述,脑出血后存在细胞凋亡,且可能与NF-κB的激活有关。进一步研究其具体机制将为脑出血的治疗提供新的思维空间。

[参考文献]

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[10]刘兵荣,丁新生,张勇,等.大鼠脑出血后核因子-κB的表达及黄芪多糖的干预作用[J].中国神经免疫学和神经病学杂志,2007,14(2):160-163.

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(收稿日期:2009-12-21)