血必净对脓毒症大鼠T细胞凋亡和PD―1/PD―L1表达的影响

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摘要：目的 探讨血必净对脓毒症T细胞凋亡和PD-1/PD-L1表达的影响。方法 选用SD大鼠60只，采用经典盲肠结扎穿孔术（cecal ligation and puncture， CLP）复制脓毒症模型，设立正常组、假手术组、CLP模型组、CLP模型加血必净组4组，CLP模型加血必净组大鼠于CLP术后腹腔注射血必净。流式细胞仪检测上述4组小鼠术后12h、24h、36h及48h胸腺T细胞凋亡、胸腺T细胞pd-1和单核细胞pd-l1表达。结果 胸腺T细胞凋亡、胸腺T细胞PD-1和单核细胞PD-L1表达在正常组与假手术组比较无统计学差异（P>0.05），CLP模型组自12h起各时间点脾淋巴细胞凋亡水平、胸腺T细胞PD-1和单核细胞PD-L1表达均较假手术组明显升高（P

关键词：脓毒症；血必净；T细胞凋亡；PD-1/PD-L1

脓毒症患者后期存在免疫抑制，PD-1是新型免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白，PD-1与其配体之一PD-L1结合可通过负性调节T细胞功能参与多种疾病的免疫调节。本课题拟探讨血必净对脓毒症大鼠T细胞凋亡和PD-1/PD-L1表达的影响，探讨血必净在脓毒症免疫抑制期的调节作用及可能机制。

1资料与方法

1.1实验动物及分组 SD大鼠60只，体重180～220g，适应性饲养1～2w，实验前禁食12 h。按随机数字表法将大鼠分为正常组（n=6）、假手术组（n=6）、模型组（n=24）、血必净组（n=24）。模型组与血必净组分别于术后12h、24h、36h及48h各处死6只并获取标本。

1.2方法 按照大鼠盲肠结扎穿孔模型（CLP）制作方法制作脓毒血症模型。模型制作前禁食12h，10%水合氯醛400mg/kg腹腔内注射麻醉，腹正中切口2cm， 在盲肠根部用4号线结扎盲肠，用14G套管针将盲肠贯通穿孔，还纳肠管于腹腔，间断缝合腹壁。术毕立即皮下注射10 m1生理盐水抗休克。假手术组只暴露盲肠后缝合皮肤，经背静脉注射生理盐水4 ml/kg。血必净组在CLP基础上经背静脉注入血必净注射液4 mg/kg。脾淋巴细胞凋亡采用原位末端凋亡检测（TUNEL）法。流式细胞仪检测胸腺T细胞PD-1和单核细胞PD-L1表达。FACS Calibur流式细胞仪系美国BD公司产品；血必净注射液由天津红日药业股份有限公司生产（国药准字Z20040033）。

1.3统计学方法 数据以（x±s）表示，统计处理采用SPSS16.0软件进行分析。同一时点组间比较用 t 检验，组间比较用q检验，P

2结果

2.1脾TUNEL染色细胞阳性率比较 对照组与假手术组之间比较无统计学差异（P=1.000）。CLP组自12h起各时间点脾淋巴细胞凋亡水平均较假手术组明显升高（P

2.2各组动物脾组织中CD3+细胞比例比较 对照组与假手术组之间脾组织中CD3+细胞比例无统计学差异（P=0.266）。自12h起各时点脓毒症组脾组织中CD3+细胞比例均较假手术组明显降低（P

2.3各组动物脾组织中CD3+细胞PD-1及单核细胞 PD-L1表达比较 对照组与假手术组之间脾组织中CD3+细胞PD-1/及单核细胞PD-L1表达无统计学差异（P=0.266）。自12h起各时点脾组织中CD3+细胞PD-1/及单核细胞PD-L1表达均较假手术组明显降低（P

3讨论

脓毒症晚期，机体表现为免疫抑制，淋巴细胞大量凋亡导致的淋巴细胞数减少可能是造成这一表现的重要因素。Hotchkiss等[1]报道死于脓毒症的患者存在明显的低淋巴细胞血症，脾脏和淋巴结中的淋巴细胞凋亡明显增加[2]。 这提示我们，纠正淋巴细胞的异常凋亡应成为治疗脓毒症新的着眼点。

机体免疫系统存在一群共抑制分子，其主要功能是抑制从中枢免疫耐受机制中逃逸的自身反应细胞和接受抗原刺激后免疫细胞的过度反应，以维持机体免疫活化和免疫耐受之间的平衡和内环境稳定。程序性死亡受体-1（programmed death 1，PD-1）是新型免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白，为CD28家族成员，能够与B7家族分子PD-L1或PD-L2结合。PD-1可表达于T细胞、B细胞、髓系细胞和胸腺细胞。PD-1与其配体之一PD-L1结合可传递负性调控信号，导致病原特异性T细胞的诱导凋亡和免疫无能。现有研究提示， PD-1/PD-L1途径在慢性病毒感染、肿瘤免疫、自身免疫性疾病等的免疫调节方面有着广泛的作用[3-7]。

脓毒症的免疫抑制期与慢性病毒感染、肿瘤、自身免疫性疾病的免疫耐受/抑制，具有一定相似性，本研究结果表明脓毒症确实存在T细胞凋亡增多的现象， PD-1/PD-L1表达增高的情况，证实了这一推测。

中医学认为脓毒症属"伤寒"、"温病"学的范畴，运用伤寒、温病的理论研究脓毒症非常合理，这不仅体现在脓毒症的临床特点与伤寒、温病的临床特点相似，更重要的是两者之间研究的对象一致。中医学在此类疾病方面积累了丰富的临床经验，整个中医学的发展史实际上就是认识治疗感染性疾病即脓毒症的历史[8]。中西医结合是治疗脓毒症的重要措施[9]。

血必净注射液是我国著名中西医结合危重病学家王今达教授历30余年临床研究，目前已广泛应用于脓毒症治疗的中药二类新药（国药准字J20040033），主要成分为赤芍、川芎、丹参、红花和当归等。该药具有活血化瘀、疏通经络、溃散毒邪的作用，可以拮抗内毒素，并抑制内源性炎性介质（TNF-α）的失控释放，与抗生素并用治疗脓毒症具有较好的临床疗效[10]。

本次研究表明血必净可以降低脓毒症T细胞凋亡，影响PD-1/PD-L1表达。说明PD-1/PD-L1可能是血必净调节脓毒症晚期免疫抑制状态，降低T细胞凋亡的重要靶点。

参考文献：

[1]Hotchkis RS，Swanson PE，Freeman BD，et al.Apoptotic cell death in patients with sepsis， shock， and multiple organ dysfunction[J].Crit Care Med，1999，27（7）：1230-1251.

[2]Hotchkis RS，Tinsley KW ，Swanson PE，et al.Prevention of lymphocyte cell death in sepsis improves survival in mice[J].Proc Natl Acad Sci USA，1999，96（25）：14541-14546.

[3]Zhang JY，Zhang Z，Wang X，et al.PD-1 up-regulation is correlated with HIV-specific memory CD8+T cell exhaustion in typical progressors but not in long-term nonprogressors[J].Blood，2007，109（11）：4671-4678.

[4]Maier H，Isogawa M，Freeman GJ，et al.PD-1：PD-L1 interactions contribute to the functional suppression of virus-specific CD8+T lymphocytes in the liver[J].J Immunol，2007，178（5）：2714-2720.

[5]Cho HY， Choi EK， Lee SW， et al.Programmed death-1 receptor negatively regulates LPS-mediated IL-12 production and differentiation of murine macrophage RAW264.7 cells[J].Immunol Lett，2009，127：39-47.

[6]Yao S， Wang S， Zhu Y， et al.PD-1 on dendritic cells impedes innate immunity against bacterial infection[J].Blood，2009，113（23）：5811-5818.

[7]Huang X， Venet F， Wang Y L， et al.PD-1 expression by macrophages plays a pathologic role in altering microbial clearance and the innate inflammatory response to sepsis[J].PNAS，2009，106（15）：6303-6308.

[8]刘清泉，篮海涛.中医对脓毒症的认识及辨证体系的研究[J].中华中西医临床杂志，2004，4（3）：261-264.

[9]王今达.脓毒症：感染性MODS的预防[J].中国危重病急救医学，1999，11：453.

[10]张畔，曹书华，崔克亮，等.血必净对多脏器功能障碍综合征单核细胞HLA-DR表达影响的研究[J].中国中西医结合急救杂志，2002，9：21，23，455.