耐力运动对高脂膳食诱导的脂肪肝小鼠UCP2与Mn-SOD表达及与脂肪肝关系的研究

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇耐力运动对高脂膳食诱导的脂肪肝小鼠UCP2与Mn-SOD表达及与脂肪肝关系的研究范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

摘要：目的：研究耐力运动对高脂膳食诱导的C57BL/6J脂肪肝小鼠肝脏ucp2及MnSOD表达与脂肪肝的关系。方法：以高脂膳食诱导的脂肪肝小鼠为模型，分析耐力运动20周后肝脏UCP2及MnSOD表达变化与肝脏脂肪变的关系。结果：肝脏UCP2与MnSOD在高脂膳食组（HS组）均显著升高；恢复正常膳食结合耐力运动20周组（RE组），MnSOD表达进一步升高，而UCP2表达显著降低。HS组形成明显的脂肪肝，恢复正常膳食加20周不运动组与恢复正常膳食结合20周耐力运动组脂肪肝得到明显改善，但RE组改善更为明显。结论：耐力运动可能以上调MnSOD表达而下调UCP2表达，达到既清除活性氧又减少肝脏线粒体ATP合成降低目的，从而保护肝脏免受过多活性氧和ATP耗尽的损伤。

关键词：脂肪肝； 解偶联蛋白2； 耐力运动；高脂膳食

中图分类号：G804.21文献标识码：A文章编号：1007-3612(2007)12-1645-04

流行病学调查表明，近年来，随着人们生活水平的提高和膳食习惯的改变，尤其是大量脂肪的摄入和运动的减少，脂肪肝的发病率有增高的趋势，这不仅在中老年人群中有很高的发病率，而且在肥胖儿童中也呈递增趋势［1］。

已有研究证明，耐力运动对脂肪肝的预防和延缓具有重要的作用。Terao T［2］等观察不同的运动强度对肝脏脂质及脂肪病变的影响，发现低强度的耐力运动对脂肪肝有明显的预防效果。

关于耐力运动预防和/或延缓脂肪肝的作用的机制还不甚明了。近年来，解偶联蛋白2的发现可能为此提供了新的视角。目前，UCP2在肝细胞中的作用尚无定论，但比较一致的意见是UCP2的作用具有两面性。一方面，肝细胞可以通过诱导UCP2 mRNA和蛋白质的表达以迅速适应脂质底物供给增加［3］，降低活性氧生成，防止脂肪肝发生；另一方面，UCP2表达增加在肝脏环境急剧变化时可能对机体造成不良后果［4］。因为UCP2表达增加使氧化磷酸化解偶联，降低ATP合成速率，增加ATP被耗竭的风险，使肝细胞对坏死更加敏感［5］；Chavin等［4］发现从ob/ob肥胖小鼠脂肪肝细胞中分离出来的线粒体，其质子漏速度增加，ATP合成减少，在短暂缺血或能量需求急剧增加时，肝脏更容易发生坏死。脂肪肝中UCP2表达上调是一把“双刃剑"，一方面：通过介导质子漏增强使线粒体内膜膜电位降低，减少线粒体活性氧生成，阻止脂肪肝发生发展；同时降低ATP合成的效率［6］，介导脂质跨膜转运，减低游离脂肪酸的酯化，增加其β-氧化［7］，减轻蓄积脂质的细胞毒性作用；另一方面，UCP2解偶联使ATP合成减少，在短暂缺血、能量需求急剧增加、应激等情况下使肝细胞ATP供不应求，引起肝细胞坏死［8］，加重脂肪肝，并向更晚期肝病进展。

由于UCP2对脂肪肝的作用存在上述矛盾，既要清除过多的活性氧又不影响ATP的合成。我们能否这样假设：耐力运动可能会通过增加抗氧化能力清除更多的活性氧而减少UCP2的表达，从而减少对ATP损失，防止脂肪肝的进一步发展。为验证我们的假设，我们开展了一下实验。

1材料与方法

1.1实验设计离乳三周龄雄性C57BL／6J小鼠27只(购自上海西普尔实验动物有限责任公司)，体重l6～20 g，随机分为4组(1)普通膳食34周对照组(N组，n=7)；(2)高脂膳食l4周组(HS组，n=7)；(3)高脂膳食l4周后+正常饮食20周组(RS组，n =7)；(4)高脂膳食l4周后+正常饮食结合20周运动组(RE组，n=6)。每天光照12小时，自由饮水。高脂饲料：10%猪油、1.5%胆固醇、0.5%胆酸钠，其余为正常饲料。正常饲料：购自天津实验动物中心。采用无负重游泳运动，水温(29±2)℃，第一周每天运动半小时，第二周增至1 h，从第三周开始增至1.5 h，每周5 d。运动20周。

1.2指标测定

1.2.1肝脏细胞脂肪变程度的光镜观察每一阶段实验动物取血处死后，取肝脏并浸入生理盐水中洗掉血污，立即放入液氮冷却，然后放入-70℃恒温冰箱保存，以备光镜观察。光镜观察采用冰冻切片，H.E染色，光镜下观察脂肪病变程度。

1.2.2肝脏UCP2及mn-sodmRNA表达测定以上述的肝脏组织， 用Trizol Reagent试剂盒（Mrcgene产品）抽提总RNA，总RNA定性定量检测后用逆转录试剂盒（Ferment产品）参照说明书进行逆转录反应，以备用于UCP2和Mn-SOD的扩增。UCP-2引物参照文献［9］，UCP2为127bp，上游5'-CAG CCA GCG CCC AGT ACC-3'，下游5'-CAA TGC GGA CGG AGG CAA AGC-3'， 内参基因β-actin的引物用Oligo 6.0软件自行设计，由北京博雅生物有限公司合成β-Actin 178bp上游5'-GCTTCTTTGCAGCTCCTTCGT-3' 下游5'-ACATCGTCATCCATGGCGAAC-3'，UCP2用荧光定量PCR进行扩增，按照two steps SYBR RT-PCR Kit (TaKaRa) 试剂盒说明书配制反应体系；温度循环参数：95℃ 5 s，59℃ 30 s，72℃1 min，40个循环进行PCR扩增反应。目的基因的相对量为：目的基因初始量 / 内参基因初始量=2（Ct目的－Ct内参）。Mn-SOD用半定量法测定，上游5'- GTGGGCCGCTCTAGGCACCA - 3'; 下游: 5'- CGGTTGGCCTTAGGGTTCAGGGGGG - 3'，长度245bp［10］；β-actin上游5′- ATTAACGCGCAGATCATGCAG- 3′下游 5′- TTTCAGATAGTCAGGTCTGACGTT - 3′，长度为483 bp［11］，均由北京博雅公司合成。Mn-SOD的反应参数：预变性94℃ 4 min，变性94℃ 45 s，退火60℃1 min，延伸72℃1 min，循环27次，终末延伸72℃ 7 min。

1.3数据处理 实验数据采用均数±标准差（x±S）表示，采用差分析，由spss11.0统计软件包进行处理。

2结果

2.1肝脏脂肪变程度的光镜观察

2.1.1正常对照组组织切片光镜下观察发现绝大部分细胞中没有脂肪滴的存在，只有少数几例出现小脂泡（图1）。

2.1.2高脂膳食不运动组（HS组，N=12,14周）组织切片光镜下观察发现，有2/3以上的肝细胞中充满脂肪滴。表明实验动物已发生明显的脂肪肝（图2）。

2.1.3恢复正常膳食不运动组（RS组，N=12，14+20周）组织切片光镜下观察发现脂肪滴数明显低于高脂膳食组（图3）。

2.1.4恢复正常膳食运动组（RE组，N=12，14+20组）组织切片光镜下观察大部分没有发现脂肪滴的存在，仅在少数肝组织中有少量脂肪滴，与正常对照组相比无明显差别（图4）。

3讨论

线粒体是细胞的“电力站"，为有机体提供90%的ATP，但它同时也是细胞中O2.-的主要恒定来源，构成生物体O2.-生产量的95%以上［12］。线粒体生成O2.-的主要部位在呼吸链复合体I和复合体III，而以后者为主。刘树森等［13］报道，大鼠心肌线粒体态 4 呼吸时，复合体III生成的O2.-和H2O2的曲线主要是与线粒体ΔΨ呈非线性相关，在Ψ高达180 mV左右 时，O2.-生成量才突然上升；此种O2.-生成对ΔΨ呈阈值现象说明线粒体O2.-的生成不是与呼吸链电子传递速率成正相关，而与其能量偶联产物，ΔΨ，呈函数相关。Skulachev进一步用自己实验证实了此结论［14］。由此可见，线粒体态4呼吸的O2.-生成量与ΔΨ呈阈值现象不但解释了高ΔΨ时呼吸链氧化速度减慢和UQ?寿命延长是复合体Ⅲ‘漏电’产生O2.-的主要原因，而且还说明线粒体能量偶联与解偶联是调节O2.-的主要机制，因为ΔΨ小幅度下降即可使O2.-的产生速率大幅降低［15］。

活性氧与脂肪肝关系密切。当大量脂肪在肝细胞中进行代谢的过程中，肝脏线粒体会产生大量的活性氧，活性氧直接或通过进一步氧化脂质使脂质过氧化引起mtDNA的突变或诱导Fas配体表达的方式引起肝脏脂肪病变［16］。脂肪肝病变会进一步导致活性氧的大量产生，这是一种恶性循环。及时有效地清除线粒体产生的活性氧是防止脂肪肝进一步恶化的有效方法。

近年来，解偶联蛋白的发现为这一思路提供了新的视角。解偶联蛋白是线粒体内膜上的一类蛋白，包括UCP1，2，3，4，5 五种。解偶联蛋白一个重要的生理功能就是通过“温和解偶联"（Mild uncoupling）的方式引起质子漏增加，导致线粒体内膜膜电位轻微降低，从而抑制线粒体活性氧的生成［17］。肝脏中解偶联蛋白2表达升高首先在肥胖ob/ob小鼠中发现［4］。肝脏中UCP2表达升高可以抑制线粒体活性氧的生成，减少对线粒体的氧化损伤，但UCP2的解偶联作用在抑制线粒体活性氧的生成的同时使质子漏增加，减少了ATP的合成，ATP的减少导致了肝脏细胞坏死的敏感性，在短暂缺血、能量需求急剧增加、应激等情况下使肝细胞ATP供不应求，引起肝细胞坏死［8］，加重脂肪肝，并向更晚期肝病进展。抗氧化能力的增强，可能为这一矛盾问题的解决提供了帮助。机体内抗氧化剂包括抗氧化酶和非酶抗氧化剂。在脂肪肝的发病过程中，我们更关心Mn-SOD抗氧化酶，因为Mn-SOD仅存在线粒体内，是预防线粒体活性氧氧化损伤的第一道屏障［18］。

耐力运动可能为此提供了一种解决问题的有效途径。本研究发现，C57BL/6J小鼠经过14周的高脂膳食后，UCP2表达显著升高， Mn-SOD表达也显著升高，而肝脏出现严重的脂肪肝病变。高脂膳食组Mn-SOD的表达显著升高，这可能是高脂膳食导致活性氧生成增加，活性氧作为信号分子诱导Mn-SOD表达上调［19］。此种上调可能还不足以清除线粒体产生的活性氧，因此，肝脏细胞动用另外的方式来满足这一需要，即UCP2上调抑制线粒体活性氧的生成。UCP2表达的显著升高是一种应激性反应，肝脏细胞可能会以损失小部分能量作代价避免受到更剧烈的氧化损伤。尽管我们没有测定肝脏中ATP的含量，推测线粒体合成能力会降低。当高脂膳食小鼠改为正常膳食20周及正常膳食加运动20周后，UCP2均比高脂膳食组显著降低，而Mn-SOD表达均显著升高，而改为正常膳食加运动组Mn-SOD升高更为显著，UCP2降低也更为显著。耐力运动可以降低线粒体UCPs的表达［20］，而上调Mn-SOD的表达［21］。结果提示，耐力运动可以提高肝脏细胞Mn-SOD的表达，降低UCP2的表达，线粒体可以通过Mn-SOD清除更多的活性氧，而无需通过UCP2以损失部分能量的方式减少线粒体活性氧的生成，从而增加了线粒体ATP的合成能力，保护了肝脏细胞。从光镜观察结果可以证实这一点，改为正常膳食和改为正常膳食加运动组肝脏细胞内脂肪滴均显著变小，数量减少，尤其是RE组改善更为明显。

4结论

耐力运动可下调高脂膳食诱导的脂肪肝肝脏线粒体UCP2表达的含量，上调Mn-SOD的表达，从而减少线粒体能量损耗及活性氧的氧化损伤，预防脂肪肝的发生。

参考文献：

［1］ 韦湘林.高脂血症与非酒精性脂肪肝的相关性分析［J］.现代中西医结合杂志, 2000,9(1):8-9.

［2］ Terao T, Fujise T, Nakano S. Effects of long-term exercise and high-cholesterol diet on lipid-lipoprotein metabolism in rats. Tokai J Exp Clin Med, 1987,12(4):243-51.

［3］ Cortez-Pinto H, Zhi Lin H, Qi Yang S, et al. Lipids up-regulate uncoupling protein 2 expression in rat hepatocytes. Gastroenterology,1999,116(5):1184-93.

［4］ Chavin KD, Yang S, Lin HZ, et al. Obesity induces expression of uncoupling protein-2 in hepatocytes and promotes liver ATP depletion. J Biol Chem,1999,274(9):5692-700.

［5］ Rashid A, Wu TC, Huang CC, et al. Mitochondrial proteins that regulate apoptosis and necrosis are induced in mouse fatty liver. Hepatology, 1999,29(4):1131-8.

［6］ Hong Y, Fink BD, Dillon JS, et al. Effects of adenoviral overexpression of uncoupling protein-2 and -3 on mitochondrial respiration in insulinoma cells. Endocrinology, 2001,142(1):249-56.

［7］ Zhou YT, Shimabukuro M, Koyama K, et al. Induction by leptin of uncoupling protein-2 and enzymes of fatty acid oxidation. Proc Natl Acad Sci U S A, 1997,94(12):6386-90.

［8］ Cortez-Pinto H, Yang SQ, Lin HZ, et al. Bacterial lipopolysaccharide induces uncoupling protein-2 expression in hepatocytes by a tumor necrosis factor-alpha-dependent mechanism. Biochem Biophys Res Commun, 1998,251(1):313-9.

［9］ Joseph JW, Koshkin V, Zhang CY, et al. Uncoupling protein 2 knockout mice have enhanced insulin secretory capacity after a high-fat diet. Diabetes, 2002,51(11):3211-9.

［10］ 金晓凌,郑树森.非病毒载体介导Mn - SOD 基因在小鼠肝脏的高表达［J］.中国病理生理杂志,2004,20(11):2067-2071.

［11］ 贾松,吕立夏,杨翠香,等.丙烯酰胺对小鼠小脑SOD 基因表达的影响［J］.同济大学学报( 医学版), 2003,24(1):28-30.

［12］ Liu SS. Cooperation of a “reactive oxygen cycle" with the Q cycle and the proton cycle in the respiratory chain――superoxide generating and cycling mechanisms in mitochondria. J Bioenerg Biomembr, 1999,31(4):367-76.

［13］ Liu Shusen,Huang Jinping. Coexistence of ‘Reactive oxygen cycle’ with Q cycle in the respiratory chain of mitochondria. In“Natural Antioxidants:Molecular Mechanism and Health Effects". Champaign. IL : AOCS Press, 1996:513-526.

［14］ Skulachev VP. Uncoupling: new approaches to an old problem of bioenergetics. Biochim Biophys Acta, 1998,1363(2):100-24.

［15］ Brand MD. Uncoupling to survive? The role of mitochondrial inefficiency in ageing.Exp Gerontol, 2000,35(6-7):811-20.

［16］ Angulo P. Nonalcoholic fatty liver disease. N Engl J Med, 2002,346(16):1221-31.

［17］ Negre-Salvayre A, Hirtz C, Carrera G, et al. A role for uncoupling protein-2 as a regulator of mitochondrial hydrogen peroxide generation. FASEB J, 1997,11(10):809-15.

［18］ Silva JP, Shabalina IG, Dufour E, et al. SOD2 overexpression: enhanced mitochondrial tolerance but absence of effect on UCP activity. EMBO J, 2005,24(23):4061-70.

［19］ Ranganathan AC, Nelson KK, Rodriguez AM, et al. Manganese superoxide dismutase signals matrix metalloproteinase expression via H2O2-dependent ERK1/2 activation. J Biol Chem, 2001,276(17):14264-70.

［20］ Boss O, Samec S, Desplanches D, et al. Effect of endurance training on mRNA expression of uncoupling proteins 1, 2, and 3 in the rat. FASEB J, 1998,12(3):335-9.

［21］ 黄丽英. 游泳训练对高脂膳食大鼠超氧化物歧化酶基因表达的作用［J］.广州体育学院学报,2004,24(2):41-43.

“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文”