Co2+对聚酰胺胺树状大分子和牛血清蛋白相互作用的影响

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[摘要] 目的 研究co2+对具有不同末端基团的聚酰胺胺（PAMAM）树状大分子与牛血清白蛋白（BSA）的相互作用，并探讨其作用机制。 方法 采用紫外光谱法研究以乙二胺为核的PAMAM树状大分子与Co2+的相互作用。应用荧光光谱法研究生理条件下（pH=7.4）PAMAM、BSA、Co2+三者之间的相互作用。 结果 Co2+可与G4.0 PAMAM配位，而与G3.5 PAMAM几乎无作用；两类PAMAM及Co2+均导致BSA的内源性荧光猝灭，但Co2+对BSA的猝灭几乎可以忽略；Co2+导致了整代PAMAM与BSA的猝灭常数减小，而对半代PAMAM与BSA的相互作用影响不大。 结论 Co2+的存在可在一定程度上影响具有末端氨基的PAMAM树状大分子与BSA间的相互作用，对研究该类药物载体与BSA的结合有指导作用。

[关键词] PAMAM树状大分子；牛血清白蛋白；Co2+；荧光猝灭

[中图分类号] O631.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）07（c）-0099-04

聚酰胺胺（PAMAM）树状大分子是由Tomalia等[1]首次合成的一类新型的聚合物，具有较大的内部空腔和大量的端基官能团，可与多种有机小分子或聚合物结合，并且具有细胞毒性低等许多独特的生物性状。正是由于这些优势使其非常适宜作为药物和基因的转运载体[2-4]。众所周知，多数药物进入人体后，必须通过血浆的储存和运输才能到达靶部位，进而发生药理作用。血清白蛋白是血液中一类重要的蛋白质，对许多内源性和外源性的药物都具有较高的亲和力[5]。血清白蛋白还可与许多金属离子结合，另有报道显示，具有不同末端基团的PAMAM也可与多种金属离子（Cu、Zn、Co、Ni、Pb、Cd）发生配位作用[6-7]。因此，研究PAMAM，金属离子与白蛋白的相互作用，对阐明该药物载体在体内的转运、分布和代谢等具有重要意义。

本实验利用紫外-可见光谱法研究Co2+与PAMAM树状大分子的配位作用；利用荧光光谱法研究PAMAM树状大分子在生理条件下与牛血清白蛋白、Co2+三者的作用，并探讨相互作用机制，以及对蛋白构象的影响。

1仪器与试药

1.1 试剂

3.5代（G3.5，具有末端酯基）和4.0代（G4.0，具有末端氨基）以乙二胺为核的PAMAM 树枝状大分子，实验室自制；牛血清白蛋白BSA（组分Ⅴ，生化试剂，南京大冶生物科技有限公司）；CoCl2（分析纯，上海振兴试剂厂）；三羟甲基氨基甲烷；实验用水为二次蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

RF5301型荧光分光光度计（日本岛津公司）；UV2100型紫外分光光度计（日本岛津公司）；pHS-25型酸度计（上海伟业仪器厂）；BS 124S型电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]。

2 方法与结果

2.1 紫外光谱法研究G4.0 PAMAM和G3.5 PAMAM与Co2+配位作用

配制一定浓度的G3.5 PAMAM和G4.0 PAMAM树状大分子与Co2+的混合体系，在波长为200～800 nm的范围内扫描紫外光谱，狭缝宽度为2.0 nm[8]。

2.2 各类PAMAM树状大分子对牛血清白蛋白荧光的猝灭作用

将BSA溶解于pH为7.4的Tris-HCl缓冲盐溶液（缓冲液含NaCl的浓度为100 mmol/L）中，配制成终浓度为5 μmol/L的溶液。室温下测定上述浓度溶液的荧光光谱。激发波长选择295 nm，发射波长为300～460 nm[9]。然后向BSA溶液中分别加入不同浓度的各类树状大分子溶液，在同样条件下测定其荧光光谱，记录荧光强度。

2.3 Co2+对牛血清白蛋白荧光的猝灭作用

按照“2.1”项下方法，向BSA溶液中分别加入不同浓度的Co2+，测定其荧光光谱，记录荧光强度。

2.4 Co2+对PAMAM树状大分子和BSA相互作用的影响

将BSA溶解于pH为7.4的Tris-HCl缓冲盐溶液（NaCl浓度100 mmol/L）中，配制成浓度为5 μmol/L的溶液。然后向其中分别加入一定量的CoCl2溶液，制成BSA- Co2+二元猝灭体系[10-11]，按照“2.2”项下方法测定其荧光光谱。随后向该混合溶液中加入不同浓度的G4.0 PAMAM或G3.5PAMAM树状大分子溶液，在同样的条件下测定荧光光谱。

2.5 紫外光谱法研究G4.0 PAMAM和G3.5 PAMAM与Co2+配位作用结果

图1是PAMAM树状大分子水溶液在pH值为7.40，25℃下的紫外可见光吸收光谱图。从图中可以看出，该溶液在紫外区有较大吸收，而在可见光区几乎无吸收。

图2是不同代数PAMAM与Co2+溶液在pH值为7.40，25℃下相互作用后的紫外可见吸收光谱图，分为紫外区的吸收光谱和可见光区的吸收光谱两个部分。从图2中可以发现，加入G4.0 PAMAM树状大分子时，最大吸收波长为356 nm；加入G3.5 PAMAM树状大分子时，溶液在可见光区域几乎没有吸收。在实验过程中还观察到，当向Co2+溶液中加入G4.0 PAMAM后，溶液瞬间由原来的粉红色变为亮黄色，而加入G3.5 PAMAM溶液没有变化。

2.6 各类PAMAM树状大分子对牛血清白蛋白荧光的猝灭作用结果

图3是295 nm激发波长下不同浓度G4.0 PAMAM对BSA荧光光谱的影响，加入树状大分子后荧光强度降低。对于所有类型的树状大分子，它们浓度的增加均可引起色氨酸残基荧光的线性下降，并且通过稳定性考察发现这种猝灭作用瞬间即可达到稳定状态。上述现象说明PAMAM树状大分子同BSA之间存在相互作用。

图4是根据公式F0/F=1+Ks[Q]（其中F0为猝灭体不存在的荧光强度，F为加入猝灭体后的荧光强度，Ks为双分子猝灭常数，[Q]为猝灭体浓度）得到的各类树状大分子对BSA荧光猝灭的Stern-Volmer曲线图。

树状大分子对色氨酸荧光猝灭的Stern-Volmer常数见表1。Ksv值越大，则说明PAMAM树状大分子与BSA间的相互作用越强。根据表1中Ksv数据推测PAMAM树状大分子与BSA的相互作用强弱顺序：G4.0>G3.5。并且各种猝灭剂对生物大分子最大动态猝灭过程的猝灭常数都不大于0.2 L/mmol[12～13]，而表1中的各Ksv值均大于此值，可由此推断该猝灭过程是由于各类树枝状大分子与BSA之间形成了配合物所引起的静态猝灭，而非树状大分子扩散时所引起的动态猝灭。

G4.0 PAMAM浓度：1：0 mmol/L；2：0.010 mmol/L；3：0.020 mmol/L；4：0.030 mmol/L；5：0.040 mmol/L；6：0.050 mmol/L；7：0.060 mmol/L；8：0.070 mmol/L；9：0.080 mmol/L；10：0.090 mmol/L；11：0.100；BSA浓度：5.0 μmol/L

2.7 荧光光谱法研究Co2+对BSA的猝灭作用

图5为Co2+对BSA的荧光猝灭光谱图，经Stern-Volmer方程[y=0.2533x+1.0124，其中x为Co2+浓度（mmol/L），y为F0/F，相关系数r=0.9973]处理后得图6，由图6可见，加入高浓度Co2+后，F0/F值只发生略微增加，说明Co2+对BSA的猝灭作用很小，其Ksv值仅为0.2533 L/mmol。

Co2+浓度：1：0 mmol/L；2：0.040 mmol/L；3：0.080 mmol/L；4：0.120 mmol/L；5：0.160 mmol/L；6：0.200 mmol/L；7：0.240 mmol/L；8：0.280 mmol/L；9：0.320 mmol/L；10：0.360 mmol/L；11：0.400；BSA浓度：5.0 μmol/L

2.8 荧光光谱法研究PAMAM树状大分子对Co2+和BSA相互作用的影响

图7为PAMAM树状大分子对BSA-Co2+二元体系的荧光猝灭光谱图。随着PAMAM树状大分子浓度的增加，荧光猝灭增强。由其Stern-Volmer曲线（图8，yG4.0 PAMAM=1.7170x+1.0053，yG3.5 PAMAM=1.3410x+1.0093，其中x为相应PAMAM浓度（mmol/L），y为F0/F，相关系数r=0.9984，0.9971）和表2可知，Co2+的存在使G4.0 PAMAM树状大分子对BSA的猝灭降低，Ksv值由2.7358 L/mmol降至1.7170 L/mmol，这可能是由于Co2+先与PAMAM之间发生了较强的配位作用，导致G4.0 PAMAM与BSA结合的区域构型、电荷等发生变化，使G4.0 PAMAM树状大分子对BSA的猝灭减弱，也可能是由于Co2+优先占据了BSA的某些位点且很稳定，从而减弱了PAMAM与BSA的结合。而G3.5 PAMAM与Co2+基本不发生配位作用，因此Co2+的加入基本上对猝灭作用没有影响。

G4.0 PAMAM浓度：1：0 mmol/L；2：0.010 mmol/L；3：0.020 mmol/L；4：0.030 mmol/L；5：0.040 mmol/L；6：0.050 mmol/L；7：0.060 mmol/L；8：0.070 mmol/L；9：0.080 mmol/L；10：0.090 mmol/L；11：0.100；BSA-Co2+浓度：5.0 μmol/L；Co2+浓度：5.0 μmol/L

3 讨论

采用紫外光谱法研究两类PAMAM树状大分子与Co2+的相互作用，结果表明应，Co2+可与G4.0 PAMAM配位，而与G3.5 PAMAM几乎无作用。由于加入G4.0 PAMAM时，Co2+同其端基-伯胺基配位，使得Co2+的d轨道分裂能ΔE值增大，两者混合溶液在可见光区域最大吸收波长向短波方向移动。对于G3.5 PAMAM而言，由于其端基-酯基的配位能力弱，很难与Co2+配位，另外由于PAMAM树状大分子的球体外形，当温度低于25℃时，Co2+克服不了G3.5 PAMAM的空间位阻，不能进入到其分子内层与叔胺基进行配位[14]，所以导致了G3.5 PAMAM与Co2+的混合溶液在可见光区域几乎没有吸收。用荧光光谱法研究生理条件下（pH=7.4）PAMAM、BSA、Co2+三者之间的相互作用，研究结果表明，在Co2+-BSA体系中，Co2+对BSA的猝灭作用很小，Co2+导致了G4.0 PAMAM与BSA的猝灭常数明显减小，Ksv值由2.7358 L/mmol降至1.7170 L/mmol，而对G3.5 PAMAM与BSA的相互作用影响不大，Ksv值由1.3447 L/mmol至1.3410 L/mmol。这可能是由于Co2+先与PAMAM之间发生了较强的配位作用，导致G4.0 PAMAM与BSA结合的区域构型、电荷等发生变化，使G4.0 PAMAM树状大分子对BSA的猝灭减弱，也可能是由于Co2+优先占据了BSA的某些位点且很稳定，从而减弱了PAMAM与BSA的结合。而G3.5 PAMAM与Co2+基本不发生配位作用，因此Co2+的加入基本上对猝灭作用没有影响。

由此可见，Co2+的存在可在一定程度上影响具有末端氨基的PAMAM树状大分子与BSA间的相互作用，对研究该类药物载体与BSA的结合有指导作用。

[参考文献]

[1] Tomalia DA，Baker H，Dewald JR，et al. A new class of polymer：starburst-dendritic macromolecules [J]. Polymer J，1985，17（1）：117-132.

[2] 王晓杰，唐善法，田磊，等.聚酰胺-胺树枝状大分子合成方法与应用现状[J].精细石油化工进展，2013，14（5）：41-44.

[3] 贺绍珑，杨美燕，高春生，等.“纳米化抗生素”给药系统的研究进展[J].中国新药杂志，2013，22（18）：2142-2147.

[4] 王持，潘仕荣，吴红梅，等.聚酰胺-胺树枝状高分子的聚乙二醇改性及作为基因载体的性能[J].药学学报，2011， 46（1）：102-108.

[5] Cheng ZJ，Zhang YT. Fluorometric investigation on the interaction of oleanolic acid with bovine serum albumin [J]. Molecular Structure，2008，879（1-3）：81-87.

[6] Sali S，Grabchev I，Chovelon JM，et al. Selective sensorsfor Zn2+ cations based on new green fluorescent polyam idoam ine dendriners peripherally modified with 1，8 naphthalin ides [J]. Spectroch in ica A cta Part A，2006，65：591-597.

[7] Kunio E，Keiko M，Tomokazu Y. Comparison of PAMAM-Au and PPI-Au nanocomposites and their catalytic activity for reduction of 4-nitrophenol [J]. Journal of Colloid and Interface Science，2002，254：402-405.

[8] 杨睿，刘绍璞.某些分子光谱分析法测定蛋白质的进展[J].分析化学评述与进展，2001，29（2）：232-241.

[9] 勒玉娟，段晓博，林雨萌，等.金属离子修饰的ZnS/PAMAM纳米复合材料的荧光性能研究，2013，33（3）：663-667.

[10] 陈国珍，黄贤智，郑朱梓，等.荧光分析法[M].2版.北京：科学出版社，1990：439.

[11] 章昌华，胡剑青，涂伟萍.聚酰胺胺树状大分子与Co2+的相互作用[J].华南理工大学学报，2007，35（4）：30-33.

[12] 阎波，赵临，王文华，等.冷冻对CuCl2溶液水团簇结构及CuCl2与牛血清白蛋白相互作用的影响[J].无机化学学报，2010，26（3）：500-508.

[13] 蒋新宇，李文秀，陈景文.锌离子存在下槲皮素、杨梅素与牛血清蛋白的结合[J].无机化学学报，2008，24（10）：1588-1595.

[14] Zhang CH， HU JQ， TU WP. Comparison of the Complexation between Cu（superscript 2+） and Co（superscript 2+） with Polyamidoamine Dendrimer [J]. Journal of shaanxi university of science and technology，2006，24（5）：35-38.

（收稿日期：2014-03-20 本文编辑：卫 轲）