芪丹通脉片对缺血再灌注大鼠心肌损伤的保护作用
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摘要：目的 观察芪丹通脉片预处理对缺血再灌注大鼠心肌细胞损伤的影响。方法雄性SD大鼠随机分为4组，即假手术组(A组)、缺血再灌注模型组(B组)、芪丹通脉片加缺血再灌注Ⅰ组(C组)、芪丹逼脉片加缺血再灌注Ⅱ组(D组)。大鼠麻醉开胸，结扎冠状动脉前降支40min，再灌注4h。采用Evan’sBlue和TTC染色测定心肌梗死范围，井TUNEL法测定大鼠心肌组织的细胞凋亡，检测血清中肌酸激酶(CK)和肌钙蛋白Ⅰ(cTn I)的水平。结果不同剂量(1.08 g／kg，3.24 g／kg)芪丹通脉片预处理组，缺血／再灌注后心肌梗死面积和凋亡指数显著小于模型组(P＜0.05或P＜0.01)；与假手术组比较，缺血／再灌注4h后B组大鼠血清CK和cTnⅠ有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)；而不同剂量芪丹通脉片预处理组再灌注后血青CK和cTnⅠ含量明显降低，与B组比较有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。结论：芪丹通脉片预处理能够有效地抑制缺血／再灌注所致大鼠心肌损伤。
关键词：芪开通豚片，再灌汪损伤；心肌；细胞凋亡；大鼠
中图分类号：R542.2 R285.6 文献标识码：A 文章编号：1672－1349(2007)09－0821－03
急性心肌梗死后应用溶栓术、经皮冠状动脉血管成形术等方法快速恢复冠状动脉血流的再灌注策略对于挽救可用性心肌是必要的。然而，再灌注可引起心肌损伤加重，心肌细胞的进一步丢失和功能恢复障碍，缺血／再灌注损伤(ischemm repet-fusion injury，I／IR)是医学面临的新临床问题。细胞凋亡是再灌注中心肌细胞丢失、心功能恢复障碍的病理机制之一。抑制细胞凋亡被证明能够有效抑制再灌注损伤的重要策略。益气活血复方芪丹通脉片具有益气活血、化瘀通脉的功效(专利号：2006100419006)，用于防治缺血性心脏病能够保护心肌。但其对于缺血／再灌注心肌损伤的影响还不清楚。本研究制备了缺血/在灌注大鼠心肌损伤模型，观察不同剂量的芪丹通脉片对缺血／再灌注心肌梗死范围、心肌细胞凋亡以及血清中心肌损伤标志物的影响。
1 材料与方法
1．1 实验材料 健康成年雄性SD大鼠24只，260 g±20 g，第四军医大学动物中心提供，合格证号：200505。
1．2 药品和主要试剂：芪丹通脉片(Qiantongmai tablet，QDTMT)提取浸膏干粉(黄芪30 g，丹参30 g，当归15 g，红花30 g，桂枝10 g。每克干粉含生药2.862 g。以生理盐水配制成混悬液324 g／L，第四军医大学科研药厂提供)，TUNEL试剂盒为Roche公司产品。
1．3 实验方案 将大鼠随机分为4组，每组6只，假手术组(A组)，动物开胸，冠状动脉下穿线但不结扎；缺血再灌注模型组(MI／R，B组)；芪丹通脉片处理加缺血再灌注Ⅰ组(QDTMT－I，C组)；芪丹通脉片处理加缺血再灌注Ⅱ组(QDTMT－Ⅱ，D组)。
A组和B组给予生理盐水10 mL／(kg・d)灌胃，C组和D组分别给予浸膏混悬液1 08 g／kg和3.24 g／kg灌胃10 mL(kg・d)均连续灌胃6 d。第7天，灌胃完成30min后进行造模。
1．4 心肌缺血再灌注模型制备
1．5 心肌梗死范围的测定 实验结束时，重新结扎包绕在冠状动脉左降支的丝线，经颈动脉快速注入10 g／Evan’s兰(2mL)染色区分缺血区(area at risk，AR)和非缺血区(显示为蓝色)。通过Optimax图像处理软件进行分析，并计算梗死面积(infaictsize)与缺血区面积(meaatrisk，AAR)的比值(％，IS／AAR)。
1．6 TUNEL法测定心肌细胞凋亡应用TUNEL凋亡检测试剂盒严格按照原位细胞凋亡检测试剂盒(POD)说明书进行操作。检测前对石蜡切片进行微波修复。以标记前用DNA酶处理切片做阳性对照；在染色过程中用PBS代替TdT反应液，其余同说明书操作，作为阴性对照。
1．7 肌酸激酶(CK)和肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)的测定实验结束时由颈动脉采血，室温静置30 min，3000i/min离心15 min，取上清，－20℃存放待测。采用微粒子化学发光法由BeckmanCouker AccessⅡ全自动免疫分析仪及其套餐试剂盒测定cTnⅠ；全自动生化分析仪测定血清中的CK。
1．8 统计学处理数据以均数±标准差(x±s)表示，应用SPSS 10.0软件进行数据统计，同组前后使用配对t检验，组间比较应用方差分析。P＜0.05为有统计学意义。
2 结 果
2．1 芪丹通脉片对缺血/再灌注大鼠心肌梗死面积的影响缺血/在灌注后的心脏经Evan’s兰染色后，染色的缺血区呈砖红色，而梗死区为灰白色。B组心肌梗死面积占缺血区的49.1％±10.3％，C组、D组心肌梗死面积分别为36.7％±8.9％和28.8％±8.4％，与B组比较均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。
2．2 芪丹通脉片对缺血/再灌注大鼠心肌细胞凋亡的影响TUNEL染色结果显示，凋亡心肌细胞核缩小，染色不均，细胞核被明显染成棕红色。B组心肌细胞凋亡指数为21.3±4.2，C组、D组为14.3±3.8和10.6+2.0，与B组比较，芪丹通脉片能够减少心肌细胞的凋亡指数(P＜0.05或P＜0.01)。
2．3 芪丹通脉片对缺血/再灌注损伤大鼠血清CK和cTn Ⅰ影响再灌注4 h后B组血清CK和cTh Ⅰ分别为12.801 84U/L±4102 70U/L和64891ng/mL±13.03ng/mL，与A组(1552 83 U/L±451.07U/L和1.40 ng/mL±0.64 ng/mL)比较有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)；而不同剂量芪丹通脉片处理组再灌注后血清中CK和cTn Ⅰ的含量分别为10 017 17U/L±3345 46U/L与6973 50U/L±177.8 40U/L和47.23 ng/mL±12.76 ng/mL与35.13ng/mL±14.42 ng/mL，与B组比较，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。
3 讨 论
缺血性心脏病的病理改变是缺血心肌细胞因缺氧而坏死或凋亡，尽早恢复血液灌流是治疗缺血性心脏病的首要措施。然而，再灌注损伤成为病人从缺血后复流获益的最大障碍。通过包括预处理和后处理等措施能够抑制缺血/再灌注所致的心肌损伤。然而，在临床应用时，预处理和后处理均需准确预见到缺血或再灌注发生的时间；需要准确控制短暂间歇性循环缺血一再灌注实施的时间；机械刺激的方式力度的掌握均影响保护效应。这些固有的缺陷给应用上述两种机械方式获得保护心肌的作用带来困难。因此发现模拟其作用的药物对于临床抑制再灌注后心肌的损伤有重要意义。
凋亡是导致缺血/再灌注损伤、心肌细胞丢失的重要病理形式之一。虽然缺血和再灌注过程与心肌细胞凋亡发生的相关性还存在争论，但三磷酸腺苷(ATP)在缺血期的缺少和再灌注期间恢复的变化特点与凋亡的能量依赖特征为再灌注中凋亡的存在提供了直接证据。尽管再灌注导致心肌细胞凋亡的机制尚不清楚，但大量实验研究结果显示：通过预处理或后处理策略减少再灌注心肌细胞的凋亡能有助于心肌功能恢复。CK作为心肌受损的重要指标，动态监测CK的水平，并计算CK时间下的面积能够反映再灌注后心肌损伤的程度，临床应用该面积作为评价再灌注成功与否的指标。cTn Ⅰ是反映心肌损伤的敏感血清学指标，也是反映心肌损伤的特异性指标。
芪丹通脉片主要成分为黄芪、丹参、红花、当归、桂枝等。方中黄芪、丹参配伍益气活血，化瘀而不耗气伤血，共为君药，当归、红花为臣，补血活血，桂枝为佐使药，辛温通阳，疏通脉络，并兼引诸药归于心经之力。诸药配伍，具有益气活血、化瘀通脉的功效。既往有研究表明其可增加血清中内皮生长因子的表达。在本实验中，药物连续灌胃7 d后，应用结扎大鼠冠状动脉左降支制备急性I/RI模型，研究发现，染色后不同组心肌中出现蓝色、红色和灰白色的区域，模型制备成功。而不同剂量的芪丹通脉片组均能够使缺血(40 min)/再灌注(4 h)所致的心肌梗死范围减小，并能够降低再灌注后心肌细胞的凋亡指数，与对照组均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。研究中发现芪丹通脉片能够抑制缺血/再灌注所致的大鼠血清CK和cTn Ⅰ增高，表明芪丹通脉片能够抑制了缺血/再灌注对大鼠心肌的损伤程度。因此，芪丹通脉片能够提高心肌细胞对再灌注损伤的耐受能力，抑制再灌注所致的心肌细胞凋亡和心肌组织的破坏。其机制有待进一步研究。