活血化瘀汤对大鼠视网膜急性损伤后Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

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摘要：目的观察大鼠视网膜急性损伤后Bcl-2和Bax蛋白表达的变化及活血化瘀汤干预的结果。方法随机将65只大鼠分为3组：对照组（A组）、加压组（B组）、加压+活血化瘀汤组（C组）。用免疫组化法检测3组大鼠视网膜急性损伤后不同时间点bcl-2和bax蛋白的表达。结果A组视网膜神经节细胞层可见一定量的Bcl-2和Bax蛋白表达；B组Bcl-2蛋白表达在2 h开始升高，36 h达峰值，72 h恢复正常，12 h到48 h各时间点与A组的差异有统计学意义（P＜0.01）；Bax蛋白表达的变化与Bcl-2相近，不同的是达峰值在24 h。C组12 h至48 h与B组相应时间点比较，Bcl-2蛋白表达的差异有统计学意义（P＜0.05），Bax蛋白表达与B组的差异无统计学意义（P＞0.05）。结论急性视网膜损伤后Bcl-2、Bax蛋白表达均升高，活血化瘀汤上调了Bcl-2蛋白表达，未影响Bax蛋白表达。

关键词：急性视网膜损伤；Bcl-2；Bax蛋白表达；活血化瘀汤；大鼠；动物疾病模型

中图分类号：R774.1文献标识码：A 文章编号：1672-979X(2008)09-0034-04

Effects of Huoxuehuayutang on Bc1-2 and Bax Protein Expressionsin Rat Retina after Acute Injury

LI Guo-feng, ZHANG Jun-fu, ZHONG Wen, DING Li-xia

(The People’s Hospital of Weifang City, Weifang 261041, China)

Abstract：Objective To observe the changes of Bcl-2 and Bax protein expressions in rat retina after acute injury and study the intervention effects of Huoxuehuayutang on Bcl-2 and Bax protein expressions. Methods Sixty-five rats were randomly divided into control group (A), pressure-loading group (B) and pressure loading-Huoxuehuayutang treatment group (C). After acute injury, the Bcl-2 and Bax protein expressions at different time points were detected by immunohistochemical method.Results The Bcl-2 and Bax protein expressions were seen in the retinal ganglion cell layer in Group A. In Group B, the Bcl-2 protein expression began increasing at 2 h，reached the peak at 36 h，recovered to normal at 72 h. Compared with Group A, Bcl-2 and Bax proteins in Group B significantly increased from 12 h to 48 h after acute injury（P＜0.01）. The Bax protein expression was similar to that of Bcl-2 protein except that the peak appeared at 24 h. In Group C, the Bcl-2 protein expression significantly increased from 12 h to 48 h after acute injury compared with Group B(P＜0.05), but there was no statistical difference in Bax protein expression between two groups(P＞0.05). Conclusion The Bcl-2 and Bax protein expressions increase in rat retina after acute injury. Huoxuehuayutang can up-regulate the Bcl-2 protein expression, but has no effect on the Bax protein expression.

Key words：acute retinal injury; Bcl-2; Bax protein expressions; Huoxuehuayutang; rat; animal disease model

近年很多研究观察了心、脑、肝、肾等组织急性损伤后Bcl-2和Bax蛋白表达与细胞凋亡的关系，但尚无视网膜急性损伤后Bcl-2和Bax蛋白表达变化的报道。多年来我们为急性闭角型青光眼患者行激光治疗或手术后用活血化瘀汤对视神经行保护治疗，临床观察有一定的疗效，但其机制尚不清楚。本实验应用免疫组化方法观察了活血化瘀汤对大鼠视网膜急性损伤后Bcl-2和Bax蛋白表达的影响，探讨了活血化瘀汤的保护机制，为进一步实验及临床研究打下了基础。

1材料与方法

1.1动物分组及模型建立

健康Wistar大鼠65只（青岛大学实验动物中心提供），体重200~230 g，雌雄不限，无眼疾，眼压测量在正常范围。实验前将动物置于室内适应环境1周，室温18～20 ℃，相对湿度65 %。随机分为对照组（A组）5只、加压组（B组）30只和加压+活血化瘀汤治疗组（C组）30只。然后按再灌注时间将B组和C组分为2，12，24，36，48，72 h时间点组，每组各5只大鼠。用生理盐水前房加压制作视网膜急性损伤模型：腹腔注射10 %水合氯醛0.8mL麻醉后，将连接生理盐水瓶输液管的5号半头皮针刺入大鼠左眼前房，升高输液瓶至与动物垂直距离150 cm，持续45 min。

1.2主要试剂及药物

兔多克隆抗鼠Bcl-2抗体、兔多克隆抗鼠Bax抗体（美国SantaCruz公司）；免疫组化染色试剂盒（北京中同生物技术公司）；DAB显色试剂盒、多聚赖氨酸（北京中山生物技术公司）。活血化瘀汤由我院中药制剂科提供，按原方比例（丹参8 g、桃仁3 g、红花5 g、当归6 g、川芎3 g、赤芍4.5 g）配伍，用10倍量水煎煮2次，每次1 h，合并水煎液用旋转蒸发仪浓缩，制成含生药2.5 g/mL的药液备用。

1.3给药方法

C组于制模前3 d开始灌胃每天4次，分别在7 时、12时、17时、22时。灌胃容量均为20 mL/(kg・d)。动物苏醒后继续如前灌胃。A、B组用生理盐水灌胃，方法、时间、用量同C组。

1.4实验方法

各组大鼠腹腔注射过量水合氯醛致死后，立即摘除眼球，固定于4 %多聚甲醛溶液内（常温24 h）。去除角膜和晶体、玻璃体，余下的眼杯常规脱水，透明，浸蜡，制成蜡块。每个组织块均取5 μm厚的切片用于免疫组织化学染色。染色方法：常规脱蜡至水，3 % H2O2去离子水孵育5～10 min，以消除内源性过氧化物酶活性。蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min。微波（95 ℃，10 min）修复抗原。用正常山羊血清滴加封闭，室温孵育10～15 min，倾去。滴加1∶200一抗（阴性对照用生理盐水代替一抗），37 ℃孵育2～3 h或过夜。滴加生物素化二抗工作液（生物素标记山羊抗兔IgG），室温或37 ℃孵育10～15 min。滴加辣根酶标记链霉素卵白素工作液，室温或37 ℃孵育10～15 min。其间均用PBS冲洗3次，每次3 min。DAB显色，自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。

1.5计算机图像分析及统计学处理

应用Vidas图像分析系统测定Bcl-2和Bax神经节细胞层免疫组织化学染色阳性反应强度（平均光密度A值）。每张切片随机取3个视野。数据以x－±s表示，组间比较用t检验。

2结果

2.1Bcl-2蛋白在视网膜神经节细胞层的表达

Bcl-2阳性细胞呈棕黄色。A组Bcl-2有一定量的表达，B组2 h表达开始升高，36 h达峰值。Bcl-2在视网膜神经节细胞（RGCs）层表达的A值见表1。

2.2Bax蛋白在RGCs层的表达

Bax阳性细胞呈黄色。A组Bax蛋白有一定量的表达，B组2 h开始表达增强，24 h达峰值。Bax蛋白在RGCs层表达的A值见表2。

2.3Bcl-2/Bax的比率

3讨论

组织缺血致急性损伤后，细胞坏死、凋亡[1-4]。在对细胞凋亡的调控中，Bcl-2家族的蛋白质对线粒体内促凋亡因子的释放具有重要的调控作用。实验证明，Bcl-2具有抗细胞凋亡的功能[5-7]。Bax是Bcl-2的同源基因，其过表达可促进线粒体增加细胞色素C及凋亡因子的释放从而拮抗Bcl-2的保护效应使细胞趋于凋亡。实际上，Bcl-2和Bax蛋白形成异二聚体，Bcl-2/Bax之间的比率、协同作用最终共同决定细胞是否进入凋亡程序。正常状态下，Bcl-2/Bax比率接近1.0，不启动凋亡。当此比率变小，无论是Bcl-2相对下降，还是Bax相对上升都会启动细胞凋亡。因此，调节Bcl-2相对上升或Bax相对下降，有减少组织细胞凋亡的意义。

本实验利用提高输液瓶垂直高度在150 cm，形成14.63 kPa眼内压的方法制作大鼠视网膜急性损伤模型，观察到大鼠视网膜Bcl-2蛋白表达2 h开始升高，36 h达峰值，72 h恢复至正常水平。Bax蛋白表达2 h开始升高，24 h达峰值，72 h恢复至正常水平。经比较可见，B组Bcl-2/Bax比率在48 h前低于正常，这可能预示着细胞凋亡启动或增强。

活血化瘀汤是祖国医学中常用的方剂，各药物易得且价格低廉，无毒副作用。临床用其单药制剂治疗青光眼疗效确切[8,9]。我院配制的活血化瘀汤所用的丹参、桃仁、红花、当归、川芎、赤芍等药物对血液流变学、微循环和血液凝固性等均有改善作用。实验中观察到活血化瘀汤未影响大鼠Bax蛋白表达，仅上调了Bcl-2蛋白表达。Bcl-2/Bax比率较B组高，这可能抑制了细胞凋亡的发生。但由于对方剂的活性成分了解不多，因此，对大鼠视网膜急性损伤后Bcl-2和Bax蛋白表达变化的影响机制有待深入研究。

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