青藤碱给药后家兔血液及关节液中药物浓度变化的关系

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[摘要] 目的 利用微透析技术考察青藤碱给药后家兔血液及关节液中药物浓度变化的关系。 方法 将微透析探针植入家兔血液及膝关节液中，家兔灌胃给药或膝关节处经皮给药或腹部经皮给药50 mg/kg后，收集家兔血液及关节液中的微透析样品，采用HPLC-MS法测定微透析样品中青藤碱的浓度，观察家兔血液及关节液中青藤碱浓度变化的规律。 结果 不同的给药途径，不同的给药部位，血液和关节液中的青藤碱浓度变化的趋势是相似的，但灌胃给药和腹部经皮给药，血液和关节液中的青藤碱浓度差异有统计学意义（P < 0.05），而膝关节处经皮给药后血液和关节液中的青藤碱浓度差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 青藤碱给药后血液和关节液中的药物浓度变化趋势是相似的，但浓度高低与给药途径及给药部位有关。

[关键词] 青藤碱；微透析；血液；关节液；高效液相色谱-质谱

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）08（c）-0023-03

青藤碱（sinomenine）是中药青风藤中的生物碱单体，是青风藤抗炎、镇痛、抗风湿作用的主要有效成分。临床研究证明，青藤碱对治疗类风湿性关节炎有较好疗效[1]。目前研究治疗关节炎类药物在体内的浓度变化一般是采取全血，测定血液中的药物浓度，或者是抽取关节液进行药物浓度的分析，从而了解关节液中的药物浓度的变化[2]，而血液和关节液中的药物浓度变化之间有何种关系一直存在疑问。微透析技术是一种新型的活体细胞外液生物采样技术，具有独特的微创性和采样的连续性。体内外的实验研究表明，青藤碱符合微透析采样的条件，且已经实现了皮肤局部青藤碱含量的动态测定[3-5]。

本文建立了家兔膝关节腔微透析探针的植入方法，并以青藤碱为研究药物，利用微透析技术同步进行青藤碱不同途径、不同部位给药后家兔血液及关节液中的采样，并采用HPLC-MS测定微透析液中的青藤碱浓度，考察血液及关节液中药物浓度变化的关系，为临床研究中青藤碱制剂合理的给药方式提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

美国BAS公司微透析系统（MD1000流速控制器、MD1001灌注器推进泵、MD0100灌注器、MD1002灌注器支架）；关节用微透析探针（CMA/12，瑞士CMA公司，PC材料，活性透析膜长度为4 mm，分子截留值为20k dalton）；血液用微透析探针（CMA/20，瑞士CMA公司，PC材料，活性透析膜长度为10 mm，分子截留值为20k dalton）。

TSQ Quantum ACCESS 型液相质谱联用仪；Xcalibur 2.0数据处理系统、Surveyor自动进样器（美国Thermo公司）；X-射线拍摄仪（德国西门子公司，由广东省中医院放射科提供）；Milli-Q级纯水机（美国synthesis公司）；电子天平XR205SM-DR（瑞士precisa公司）。

1.2 药品与试剂

1.2.1 对照品 青藤碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号：0774-200105）。

1.2.2 供试品 青藤碱凝胶剂（自制）；青藤碱粉末（购于宝鸡市荣德生物工程有限责任公司，提纯后纯度为94%）。

1.2.3 试剂 甲醇（色谱纯，美国merck公司）；甲酸（色谱纯，美国Sigma公司）；肝素钠（上海蓝季科技发展有限公司）；NaCl、KCl、无水CaCl2均为国内分析纯。

1.3 实验动物

健康新西兰兔9只，雌雄各半，体重2.0～2.5 kg，由广州中医药大学实验动物中心提供（合格证号：SCXK粤2003-0001，粤监证字2007A016）。

2 方法

2.1 液相色谱-质谱条件[6]

色谱条件：色谱柱为Hypersil GOLD C18柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）；流动相为甲醇-0.1%甲酸（30∶70）；流速：0.2 mL/min；柱温25℃；进样量10 μL。

质谱条件：正离子选择反应监测（SRM）；大气压电喷雾离子源（ESI源）；毛细管温度为350℃；喷雾电压为3.5 kV；辅助气流速5 arb；鞘气压力25 kPa；用于定量分析的子离子为m/z239和m/z181，碰撞能量分别为25 Hz和34 Hz。

2.2 动物实验方法

2.2.1 探针植入方法的建立 将家兔耳缘静脉注射20%乌拉坦麻醉后，固定在解剖台上，腹股沟处皮下注射5000单位肝素钠，20 min后将CMA/20微透析探针植入家兔耳缘静脉中，用医用胶布固定[7]。用一根普通注射器的注射针头从髌韧带两侧凹陷处斜向下45°刺入后拔出，将CMA/12探针引导导管从针孔处沿着同一角度旋转着刺入，上下移动导管，确定没有阻力后拔出引导导管中的金属杆，将探针小心地插入引导导管中即可。探针植入后用X-射线确定探针的位置[8]。

2.2.2 动物分组 将家兔随机分为3组，分别为灌胃组（第1组）、腹部皮肤给药组（第2组）、膝关节处皮肤给药组（第3组）。实验前1天用8% BaS溶液将第2组家兔腹部皮肤脱毛，将第3组家兔膝关节皮肤脱毛，并涂上凡士林防止皮肤干燥，备用。

2.2.3 给药及采样方法 探针植入后以0.8 μL/min的速度进行灌流，先用林格液灌流90 min，平衡后，第1组灌胃给予青藤碱混悬液50 mg/kg，第2组在腹部皮肤处给予相同剂量青藤碱凝胶剂，并用纱布适当包扎，第3组给药部位为膝关节处皮肤，给药剂量相同。给药结束后立即开始采样，采样间隔为30 min。采样结束后继续用林格液灌流，直至采集的透析液中检测不到青藤碱，再用已知浓度的青藤碱林格氏液进行灌流，平衡90 min后收集4份透析液用于测定探针体内回收率。

2.3 微透析样品处理

微透析样品非常纯净，可不采用特殊处理，直接进样，按上述液相色谱-质谱条件进行检测，并通过体内回收率的校正将测得的浓度换算成真实的药物浓度。

3 结果

3.1 色谱图

青藤碱对照品溶液及微透析样品的两个子离子的总离子流色谱图见图1，青藤碱的保留时间约为2.35 min。

3.2 微透析样品浓度结果

以校正后的真实药物浓度对采样时间的中点作图，得到结果见图2。

采用DAS2.0药动学软件对所得数据进行处理，由结果可知，与灌胃给药相比，经皮给药后药物吸收比较慢，但药物浓度比较平稳，在同一水平维持的时间比较久。从药物浓度的变化趋势来看，三组实验动物血液和关节液中的药物浓度变化趋势是相似的，但组间差异经t检验分析显示，第1组和第2组实验动物血液和关节液中药物浓度差异有统计学意义（P < 0.05），且关节液中的青藤碱浓度明显低于血液中的青藤碱浓度，而家兔膝关节皮肤给药的第3组，关节液中青藤碱与血液中的青藤碱浓度差异无统计学意义（P > 0.05），此结果提示青藤碱用于治疗关节炎比较合理的给药方式为膝关节处皮肤经皮给药。

4 讨论

4.1 关于青藤碱的吸收方式的探讨

药物通常以循环系统作为桥梁输送到靶部位，关节炎的病变靶部位为膝关节。从本实验结果可以看出，第1组和第2组青藤碱给药后药物先吸收进入全身循环系统，再输送到关节液中，造成关节液中的药物浓度低于血液中的药物浓度，而膝关节处皮肤给药后，一部分青藤碱吸收进入血液并随着全身循环进入关节腔，而一部分药物直接透过膝关节处皮肤吸收进入关节液中，两种途径吸收的药物叠加使关节液中的药物浓度与血液中的药物浓度相当。

4.2 利用微透析技术进行采样的优势

在血药浓度法中，要考察药物在动物体内的浓度随时间的变化规律，只能在不同的时间点采集全血测定药物浓度，采血的过程会使动物体内的血容量不断减少，对实验结果造成影响，而且血液样品的处理过程也很繁琐。

如要考察关节液中的某物质的水平，传统的药动学研究方法一般是抽取关节液或切开关节腔用生理盐水浸泡后进行分析，一只动物只能得到一个数据，且无法与血药浓度法同步进行，无法考察血液和关节液中的药物浓度变化的关系，而微透析技术可以在同一动物体内多个部位同时进行长时间采样，连续跟踪关节内药物量随时间的变化，每只动物可获得大量数据。近两年来，微透析技术在国内发展迅速，应用越来越广泛。马张庆等[9]应用微透析技术研究盐酸曲马多在小鼠额叶皮质细胞外液中的药动学。刘洋等[10]测定了大鼠脑微透析液中的多巴胺。谢毅[11]建立昆明鼠H22肝癌皮下肿瘤动物模型，以微透析技术为采样方法，对羟基喜树碱磁性热敏脂质体制剂进行肿瘤局部药动学研究。微透析技术在关节腔局部的应用较少，不过已有相关报道，如邵继征等[6]将微透析探针分别植入家兔耳缘静脉和关节腔中，以青藤碱为研究药物，建立了液-质联用测定血液及关节液中青藤碱的方法。张璟等[12]将微透析技术引入大鼠关节腔部位的取样过程，建立了大鼠关节腔透析液中双氯芬酸钠的HPLC-ESI-MS的测定方法。通过一定的技术，还可以将微透析系统用于自由活动的实验动物身上，并与其他检测系统联用，实现在线分析检测，易于自动化。

[参考文献]

[1] 黄国栋，李家邦，黄媛华，等.青藤碱治疗类风湿关节炎100例临床研究[J].中国中医急症，2007，16（4）：421.

[2] 杨惠琴，陈礼荣.青藤碱注射液对兔膝骨性关节炎关节液及血清IL-6水平的影响[J].中医药导报，2007，13（10）：62-63，72.

[3] 凌家俊，李锐，周莉玲.青藤碱微透析回收率测定方法体外模拟实验[J].广州中医药大学学报，2005，22（1）：56-59.

[4] 张英丰，周莉玲，李锐.微透析法测定青藤碱大鼠体外血浆蛋白结合率[J].药学学报，2006，41（9）：909-912.

[5] 凌家俊，谢波，王岩，等.利用微透析取样技术实现皮肤局部青藤碱含量的动态测定[J].中药材，2008，31（7）：1062-1065.

[6] 邵继征，周莉玲，黄浩然，等.液-质联用测定家兔血液及关节微透析液中的青藤碱[J].中国医院药学杂志，2009，29（7）：519-522.

[7] 罗教华，舒为群，章竹君，等.家兔血液中西咪替丁的微透析-毛细管电泳测定研究[J].分析科学学报，2005，21（3）：253-255.

[8] Nada B，Lawand，McNearnay T，et al. Amino acid release into the knee joint：key role in nociception and inflammation [J]. Pain，2010，86（2000）：69-74.

[9] 马张庆，陶芳，方浩，等.应用微透析技术研究盐酸曲马多在小鼠额叶皮质细胞外液中的药动学[J].药学学报，2013，48（3）：406-410.

[10] 刘洋，李敏，侯悦，等.高效液相色谱-电化学法测定大鼠脑微透析液中多巴胺的方法建立及应用[J].药物分析杂志，2013，33（2）：255-258，262.

[11] 谢毅.羟基喜树碱磁性热敏脂质体肿瘤局部药动学研究[D].广州：广州中医药大学，2012.

[12] 张璟，陈阳，李沛，等.基于微透析技术及HPLC-ESI-MS测定大鼠关节腔透析液中双氯芬酸钠浓度及其应用[J].中国临床药理学与治疗学，2012，17（11）：1233-1239.

（收稿日期：2013-03-27 本文编辑：程 铭）