中压制备与大孔树脂联用快速分离羟基红花黄色素A

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇中压制备与大孔树脂联用快速分离羟基红花黄色素A范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

摘要：用水超声法提取红花（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ Ｌ．）中红花黄色素Ａ，提取液经Ｄ－１０１大孔吸附树脂色谱柱进行粗分，所得水及体积分数３０％的乙醇洗脱物用中压制备色谱进行两次分离纯化，所得产物经高效液相色谱分析，羟基红花黄色素Ａ纯度为９５．９６８％。该方法省时、简便、高效，值得推广应用。

关键词：红花（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ Ｌ．）；中压制备色谱；大孔吸附树脂；羟基红花黄色素Ａ

中图分类号：Ｒ２８４．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）07－1441-03

Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｘｙｓａｆｆｌｏｒ Ｙｅｌlｏｗ Ａ ｆｒｏｍ Ｓａｆｆｌｏｗｅｒ ｂｙ Ｍｅｄｉｕｍ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｃｏｌｕｍｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ Ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ Ｒｅｓｉｎ

ＷＵ Ｙｏｎｇ－ｇａｎｇ，ＬＩ Ｘｕｅ－ｙｉｎｇ

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ， Ｍｅｓｓａｇｅ， Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ， Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｙａｎｔａｉ ２６４１99， Ｓｈａｎｄｏｎｇ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｈｙｄｒｏｘｙｓａｆｆｌｏｒ ｙｅｌlｏｗ Ａ （ＨＳＹＡ） ｃｒａｆｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｗａｔｅｒ－ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｒｏｍ ｓａｆｆｌｏｗｅｒ （Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ Ｌ．） ａｎｄ ｔｈｅｎ ｓｅｐｅｒａｔｅｄ ｂｙ D-101 macroporous resin ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ． Ｔｈｅ ｗａｔｅｒ ａｎｄ ３０％ ｅｔｈａｎｏｌ ｅｌｕｔｉｏｎ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ medium pressure column chromatograph ｆｏｒ ｔｗｉｃｅ. Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ＨＰＬＣ ｒｅｓｕｌｔｓ， ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ＨＳＹＡ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｐ ｔｏ ９５．９８６％． Tｈｉｓ ｍｅｃｈｏｄ ｗａｓ ｔｉｍｅ ｓａｖｉｎｇ， ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ， ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ， ａｎｄ ｐｒｏｐａｇａｂｌｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： sａｆｆｌｏｗｅｒ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ Ｌ．）； ｍｅｄｉｕｍ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ； ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ｒｅｓｉｎ； ｈｙｄｒｏｘｙｓａｆｆｌｏｒ ｙｅｌlｏｗ Ａ（ＨＳＹＡ）

红花为菊科植物红花（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ Ｌ．）的干燥管状花，为活血化瘀的主要中药之一，用于治疗冠心病、脑血栓等心脑血管疾病［１，２］。红花的主要活性成分是红花黄色素（Ｓａｆｆｌｏｗｅｒ ｙｅｌｌｏｗ，ＳＹ），其是一种复杂的水溶性混合物，其结构中含有特殊的醌式查尔酮的结构骨架，一直是红花化学成分研究的重点［３］。ＳＹ中含量较高的是羟基红花黄色素Ａ（Ｈｙｄｒｏｘｙｓａｆｆｌｏｒ ｙｅｌlｏｗ Ａ，ＨＳＹＡ），占ＳＹ的５０％左右。ＨＳＹＡ是具有单查尔酮苷类结构的化合物，被认为是红花活血化瘀的主要效应物质［４，５］。目前分离制备ＨＳＹＡ通常采用大孔吸附树脂色谱法对红花提取物进行除杂后得ＨＳＹＡ粗品，Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ－２０凝胶柱层析法制备ＨＳＹＡ纯品［６，７］，但这些方法不适用于快速、大规模制备ＨＳＹＡ。中压制备色谱是一种快速制备色谱系统，具有上样量大、分离速度快、可梯度洗脱、成本低、在线检测等优势［８］，本研究采用水提取和大孔吸附树脂柱色谱得到粗提物，以此粗提物直接进行中压制备色谱分离纯化，经两步分离得到纯度高于９５％的ＨＳＹＡ，丰富了ＨＳＹＡ的制备技术。

１ 仪器与材料

ＥＺ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ ＩＩＩ中压制备色谱系统及Ｖｅｒｓａｔｉｌｅｒ色谱工作站（配有二元溶剂输送泵、ＵＶ检测器、自动馏分收集器，上海利穗电子科技有限公司）。色谱柱及填料：Ｃ１８－ＡＱ（ＧＨＯＤＳＢ１２Ｓ５０，５０ μｍ，北京绿百草科技发展有限公司），４ ｃｍ×１４ ｃｍ（４０ ｇ），２根串联。Ａｇｉｌｅｎｔ １２００型高效液相色谱仪，包括Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇ１３１２Ｂ二元泵，Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇ１３７９Ｂ脱气机，Ａｇｉｌｅｎｔ １３１３Ｂ自动进样器，Ａｇｉｌｅｎｔ １３１６Ｂ柱温箱，Ａｇｉｌｅｎｔ １３１５Ｂ二极管阵列检测器、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｃｈｅｍｉｓｔａｔｉｏｎ化学工作站。

乙腈（ＨＰＬＣ级，德国Ｍｅｒｃｋ公司）、三氟乙酸（分析纯，南开大学精细化学实验厂）、甲醇（色谱纯，天津市大茂化学试剂厂）、纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司，使用前经０．４５μｍ水系滤膜过滤）、Ｄ－１０１大孔吸附树脂（沧州宝恩吸附材料科技有限公司）、羟基红花黄色素Ａ对照品（中国药品生物制品检定所，批号１１１６３７－２００３０１）；红花为菊科植物红花（Ｃ． ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ Ｌ．）的干燥管状花。

２ 试验方法与结果

２．１ 水超声法提取ＨＳＹＡ

２．１．１ 高效液相色谱分析条件［９－１１］ 色谱柱：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｃ１８（２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，５ μｍ）；流动相：乙腈（Ａ）－０．０１％三氟乙酸溶液（Ｂ）；洗脱程序：０～５ ｍｉｎ：２％Ａ（体积分数，下同）；５～２５ ｍｉｎ：２％～５％Ａ；２５～３５ ｍｉｎ：５％～１０％Ａ；３５～６５ ｍｉｎ：１０％～２０％Ａ；６５～７０ ｍｉｎ：２０％Ａ。柱温：３０ ℃；流速：１．０ ｍＬ／ｍｉｎ；检测波长：２８０ ｎｍ；进样体积：２０ μＬ。

２．１．２ 标准曲线的绘制 精确称取羟基红花黄色素Ａ对照品１５．００ ｍｇ置２５ ｍＬ容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，得０．６０ ｍｇ／ｍＬ羟基红花黄色素Ａ对照品储备液，配制成一定浓度梯度的对照品溶液，按2．1．１所述条件进行色谱分析，以Ｙ表示峰面积积分值，以Ｘ（ｍｇ）表示对照品进样量，绘制标准曲线，并计算回归方程。其线性回归方程为Ｙ＝２６ ８０５．００Ｘ－２９８．３６，Ｒ２＝０．９９９ １。

２．１．３ 红花水提取液制备 称取红花药材９００ ｇ，加１５倍质量的蒸馏水超声提取２次，每次４５ ｍｉｎ，过滤，合并滤液减压浓缩至９００ ｍＬ（此时提取液含生药的浓度为１ ｇ／ｍＬ）。加入９５％的乙醇（体积分数，下同）使含醇量达到８０％，醇沉２４ ｈ，滤液减压回收至９００ ｍＬ，加５倍体积的蒸馏水沉淀２４ ｈ，离心，上清液减压浓缩至９００ ｍＬ，备用。

２．２ 大孔吸附树脂柱色谱法制备粗品ＨＳＹＡ

取上述红花水提液９００ ｍＬ上直径４０ ｍｍ×８００ ｍｍ的Ｄ－１０１大孔吸附树脂色谱柱，蒸馏水洗脱的前３个体积洗脱液（３ ＢＶ）中主要是多糖、蛋白质、鞣质等水溶性杂质，弃去，然后依次用蒸馏水、３０％的乙醇、６０％的乙醇、９５％的乙醇各３ ＢＶ洗脱，流速为１ ｍＬ／ｍｉｎ，１ ＢＶ收集洗脱液约７５０ ｍＬ，共收集１２份。

采用ＨＰＬＣ法测定每份洗脱液中ＨＳＹＡ的含量，绘制相应的洗脱曲线（图１）。根据洗脱曲线，合并含量高于０．０４ ｍｇ／ｍＬ的第１～４份洗脱液，第５~12份洗脱液由于ＨＳＹＡ相对含量较少而放弃。减压浓缩后得浸膏１８．０ ｇ，冰箱中冷冻保存，备用。

２．３ 中压制备色谱分离

为降低试验成本，本试验首先采用甲醇－水体系进行各组分分离。精确称取浸膏样品２．０ ｇ用１０ ｍＬ甲醇溶解，经０．４５ μｍ微孔滤膜过滤，注入ＯＤＳ柱中。洗脱条件为柱温：室温；波长：２８０ ｎｍ；流速：２０ ｍＬ／ｍｉｎ；线性梯度洗脱程序：在６０ ｍｉｎ内，甲醇与水的体积比由０∶１００变化为５０∶５０，中压系统分析色谱如图２，根据色谱峰情况收集洗脱液，进行ＨＰＬＣ分析。结果发现峰Ａ中ＨＳＹＡ含量较高，对其减压浓缩进行二次中压制备。线性梯度洗脱程序：在28 ｍｉｎ内，乙腈与水的体积比由０∶１００变化为３０∶７０，中压系统分析色谱如图３，根据出峰情况精确收集。

２．４ 产物的纯度分析

ＨＰＬＣ分析各洗脱液并与标准品对照，结果表明峰Ｂ为ＨＳＹＡ，其ＨＰＬＣ图谱上仅一峰（图４），由面积归一化法算得其纯度为９５．９６８％，减压浓缩后真空干燥得１３７ ｍｇ ＨＳＹＡ黄色粉末。

３ 小结与讨论

１）大孔树脂是一类有机高聚物吸附剂，注有致孔剂，不含交换基团，含有“空隙”结构，特别适合从水溶液中分离化合物［１２，１３］。本试验用大孔树脂法制备的红花粗提液采用水和乙醇洗脱效果较好。

２）采用中压制备色谱对红花大孔树脂粗提液进行分离纯化，单位时间获得的化合物量大，４ ｈ即可完成整个分离过程。分离效果好，避免了ＨＳＹＡ在开口柱上由于长时间暴露而导致分解；柱填料可以自行填装，根据所制备的ＨＳＹＡ极性较大的特点，选择Ｃ１８反相填料纯化；同时２根色谱柱串联可有效提高分辨率，本试验连续两次对红花粗提液中压色谱分离制备，第一次通过中压柱层析分段，然后再次分离制备，取得了不错的效果。在中压制备色谱分离过程中，要注意以下几个问题［５］：①化合物要溶解于系统溶剂。②化合物与固定相不存在不可逆吸附。③选择适宜的洗脱方式和流动相比例。本研究中，先后选择典型溶剂系统甲醇／水和乙腈／水进行线性梯度洗脱，连续两次分离制备，从尽可能低的浓度开始梯度洗脱以确保不丢失目标物质。

３）本试验采用大孔树脂柱色谱与中压制备色谱法结合，从红花中直接分离得到高纯度（９５．９６８％）的ＨＳＹＡ。该方法简便、快速。从２．０ ｇ粗提物中得到１３７ ｍｇ ＨＳＹＡ。值得注意的是，水洗脱除杂时应注意在除去糖类的同时应尽可能保留较多的ＨＳＹＡ，至于如何提高分离纯化效率，还有待进一步研究。

参考文献：

［１］ 施 峰，刘焱文． 红花的化学成分及药理研究进展［Ｊ］． 时珍国医国药，２００６，１７（９）：１６６６－１６６７．

［２］ 王艺蓉，白咸勇． 红花的作用及机制研究进展［Ｊ］． 滨州医学院学报，２００９，３２（６）：４５１－４５３．

［３］ 肖文英． 红花黄色素研究进展［Ｊ］． 临床医药实践杂志，２００６，１５（９）：６４６－６４９．

［４］ 金 鸣，李金荣，吴 伟．羟基红花黄色素Ａ抗氧化作用的研究［Ｊ］． 中草药，２００４，３５（６）：６６５－６６６．

［５］ 祝美珍，胡国恒，肖 健．羟基红花黄色素Ａ的应用研究进展［Ｊ］． 中西医结合心脑血管病杂志，２００７，５（１１）：１１０８－１１１０．

［６］ 安熙强，方圣鼎． 红花中黄色素和红色素的分离鉴定［Ｊ］． 中草药，１９９０，２１（４）：４４－４５．

［７］ 杨 辉，阿依吐伦・斯马义，吴桂荣，等． 羟基红花黄色素Ａ的提取及含量测定［Ｊ］．新疆医科大学学报， ２００８，３１（１０）：１３５８－１３６０．

［８］ 王 蕾，高俊康，王英平． 中压色谱快速制备西洋参果人参皂苷的研究［Ｊ］． 特产研究，２００７，２９（００４）：３９－４１．

［９］ 赵明波，邓秀兰，王亚玲，等． 高效液相色谱法测定红花中的羟基红花黄色素Ａ［Ｊ］． 色谱，２００３，２１（６）：５９３－５９５．

［１０］ 杨日丽，刘 静． ＨＰＬＣ法测定红花中羟基红花黄色素Ａ含量的研究［Ｊ］． 广东化工，２００７，３４（７）：１１２－１１４．

［１１］ ＦＡＮ Ｌ， ＺＨＡＯ Ｈ Ｙ， ＸＵ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ １０ ｍａｊｏｒ ａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ Ｌ． ｂｙ ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙ ｄｅｔｅｃｔｏｒ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，２００９，１２１６（１１）：２０６３－２０７０．

［１２］ 臧宝霞，金 鸣，李金荣． 大孔树脂－凝胶柱层析法大规模制备纯品羟基红花黄色素Ａ［Ｊ］． 心肺血管病杂志，２００８，２７（６）：３６３－３６５．

［１３］ 金 鸣， 高子淳， 李金荣，等． 大孔树脂柱色谱法制备红花黄色素和羟基红花黄色素Ａ［Ｊ］． 中草药，２００４，３５（１）：２５－２８．