超高液相在药物分析领域中的应用
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[摘要] 超高效液相色谱（UPLC）具有传统HPLC色谱所不具备的高分离能力、高灵敏度及专属性优势，针对超高液相在药物分析领域的广泛应用，本文对超高液相色谱及其与质谱联用技术在药物分析领域取得的成果，分别从药物成分分析、药代动力学两方面进行了详细阐述与总结。
[关键词] 超高液相；药物分析；液相色谱
[中图分类号] R917[文献标识码] A[文章编号] 1673-7210（2012）04（b）-0013-02
自20世纪60年代液相色谱（LC）系统推出以来，液相色谱科学已成为现代色谱技术中最活跃的分析方法之一，逐步实现了高效液相色谱（HPLC）技术、超高效液相色谱（UPLC）系统在药物分析、环境科学、生化等多项科学领域中的应用[1]。使用1.7 nm颗粒度色谱柱填料的超高液相色谱，能够在更宽的线速度范围内保持恒定柱效，大幅度改善液相色谱的分离度与灵敏度，更为有力地加强液相色谱的分离能力，使超高液相色谱与质谱（UPLC-MS）组成的正交二维分离分析系统为化合物结构鉴定、复杂体系分离分析提供了巨大便利。药物分析作为一个较为成熟的领域，是直接关系到人们的健康和生命安全的基础研究领域。将UPLC-MS技术应用于国内仿制药检验，可无需再重复大量的药理毒理和临床试验，使患者在服用不同厂家生产的相同活性成分药物时能达到相同的治疗效果，对于生物等效性与药代动力学研究军均有显著意义显得；利用UPLC-MS技术对部分常用药物建立起相应的定量方法，也能够为药物在人体中使用的有效性与安全性提供有力的科学依据。
1 超高液相在药物成分分析中的应用
超高液相色谱技术的优势突出地反映在复杂化合物的分离分析方面。尤其是我国传统中药、中成药药剂成分复杂，一般是由多味中药按比例混合并经若干化学或物理反应步骤后制成的，利用现代病理学研究中药和中成药成分以提高药效是目前中药分析的重点，UPLC-MS首先就被应用于该领域。
居文政等[2]就通过高效液相色谱梯度洗脱法定量测定了大青叶中酮类成分，从质谱裂解组分中提取得到8种类黄酮，其中6种由3组同系物组成的类黄酮成分，相似性高，常规HPLC的灵敏度、分离度均无法满足实验要求。有学者应用酸提法、UPLC-MS以醋酸铵水溶液（含0.5%乙酸）-乙腈为流动性梯度洗脱，检验得出的黄连生物碱成分指纹图谱较HPLC-MS也更加清晰，定量分析的成分检出限也均低于相同实验条件下HPLC-MS的检出限。在中成药制剂的化学成分检验中，居文政等[3]提出了UPLC-MS快速检验镇静安神类中成药的方法，可对常见非法添加化学药品如硝西泮、艾司唑仑、苯巴比妥等快速地分离分析。也有采用UPLC-MS法检出了补肾壮阳类中成药中非法添加的枸橼酸西地那非。从实验过程来看，超高液相联合质谱法较传统的高效液相色谱技术具有更高的检测速度和灵敏度，且可实现多组样本的同时一步检测，简便快速。
2 超高液相在药代动力学研究中的应用
生物样品测定是药代动力学研究的基础前提，但药物样本分析通常均表现出取样量少、待测药物浓度低及内源性杂质多等限制性因素，这就要求检测方法必须具备灵敏、精确、可靠的特征[4]。目前90%以上的药物测定所采用的都是色谱法，UPLC-MS/MS作为药代动力学中的高灵敏度检测手段，应用范围越来越广泛。超高液相所采用的小粒径填料，不仅具有耐超高压的作用，对于改善色谱峰分离度、检测灵敏度同样也可起到明显效果，尤其适用于药物成分中微量混合物的分离及高通量研究[5]。相比较来看，UPLC-MS可减弱离子源处相互竞争的化合物间的离子抑制作用，降低代谢物的共流出，并由此检出更低浓度的代谢产物，使样本复杂体系分离、化合物结构鉴定更具效率。具体来讲，超高液相在药代动力学研究中的应用主要集中于以下三方面。
2.1 化学药品的代谢分析
从UPLC/HPLC-TOF（飞行时间质谱）-MS对人尿中乙酰氨基酚代谢产物的检验结果比较看，UPLC、HPLC均可检出乙酰氨基酚形成的硫酸化代谢产物，UPLC所获取的分离度、峰宽及色谱峰信息均显著优于HPLC，并能检出HPLC无法分离分析的葡萄糖苷代谢产物；联合MS发现的碎片离子信息进行的结构鉴定结果也证实，UPLC联用MS分离复杂化合物不仅能够大幅降低药品成分检验时间，灵敏度与分离度也较高，同时可有效降低因生物样品不纯造成的分析干扰。
2.2 中药和中成药的代谢分析
随着中药药理研究、天然药化等学科领域的发展，中药药物代谢动力学已成为中药学科现代化进程中的重点研究课题。由于中药品种复杂，药物成分呈低含量和多样化特征，体内代谢后所形成的化合物体系也更为复杂，对此，UPLC-MS同样表现出在西药药代动力学研究中反映出的类似优点，其高分离度、高灵敏度等优势得到更为充分的展现。有学者研究，在质谱多反应监测（MRM）模式下分别应用UPLC/HPLC-ES-MS测定人体内5，7，4′-三羟基异黄酮、大豆异黄酮及其代谢产物可以发现，除二者间的分析时间无明显差异外，UPLC在分析时间、信噪比、峰宽等关键指标上均得到明显改善；如果采取子离子扫描模式从血清中鉴定复杂植物营养补充剂中化学成分，还能够显著地降低复杂样品离子抑制作用间的干扰[6]。在同期测定大鼠口服给药骨舒丹后血浆中代谢产物的研究中，采用0.1%水醋酸-乙腈为流动相梯度洗脱，监测淫羊藿甙、淫羊藿黄酮次苷Ⅱ、蛇床子素线性的曲线浓度范围可分别达到分别为2.00～200、（2.00～200）×10-6、（2.00～500）×10-6 mg/mL，准确度达到-6.0%-9.0%[7]。
2.3 生化药品的代谢分析
有学者在毛发周期与寿命的课题研究中采用手性荧光试剂DBD-F、DBD-PZ标记小鼠毛发中的组胺（HA）及其代谢产物，应用UPLC-ESI-TOF-MS分离分析，线性范围良好，毛发组胺与代谢产物的检测限可达到0.21、1.00、0.17、0.11 pmoL，其他毛发所含的化合物、代谢产物也可以采取同类方法进行检验。有学者测定猴血浆中SCH503034非对映异构体的实验也发现，正离子模式下应用超高液相色谱法，可将线性范围控制在1～2 500 ng/mL，批间、批内相对标准偏差分别为1.2%～3.6%和1.3%～5.5%。2.5、50、1 000 ng/mL水平时异构体回收率均超过90.0%，由此证明，UPLC可以有效地增加分析通量、灵敏度与分离度，该分析手段同样也可以广泛地应用于人体血浆样本的检测中[8]。
此外，传统HPLC-MS系统在作药物痕量分析时在表现出高灵敏度、高选择性以及对低浓度样品的确认优势时，同样也存在分离分析过程耗时过长，难以短时间内进行多类化合物样本分离工作的缺陷，改用UPLC则能够明显地提高分析通量和色谱分辨率。郑芳等[9]研究者的实验证明，UPLC-TOF-MS测定医疗废水中29种临床应用药物残留，可在14 min内实现化合物分离，分离度和信噪比明显优于传统HPLC方法，且借助于子离子及其碎片离子的鉴定，还能准确地鉴定出目标药物。
3 超高液相的应用展望
超高效液相色谱技术（UPLC）的普及与发展，其超强的分离能力和高灵敏度优势越来越多地得到药物领域研究者的重视[10]。尤其是UPLC-MS联用技术更有效地融合了超高液相的高分离性能与质谱的高鉴别特性，小颗粒填料色谱柱种类发展呈现的多样化趋势，都更好地适应了现代药物研究日新月异的发展需求，其应用前景也必然会更加广阔。
[参考文献]
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