马尾松树皮提取物对顺铂所致体外人胚肾细胞毒性的保护作用

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摘要 目的： 体外探讨马尾松树皮提取物（PMBE）对顺铂所致肾毒性的保护作用，并初步探究其作用机制。方法： 体外培养人胚肾细胞HEK293，用四甲基偶氮噻唑蓝（MTT）方法分别检测PMBE、顺铂对HEK293细胞生长的影响，以及PMBE对顺铂所致HEK293细胞毒性的保护作用；并检测各组细胞内的活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）含量，以及过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和硫氧还蛋白酶（TrxR）的活性。结果： PMBE低浓度下促进HEK293细胞生长，较高浓度下对细胞产生轻微毒性；顺铂抑制HEK293细胞生长，使细胞内ROS，MDA含量升高，GSH含量降低，同时降低SOD，CAT和TrxR酶活性；加入PMBE预保护后，在一定范围内降低顺铂对HEK293细胞的损伤，降低ROS，MDA含量，升高GSH含量，以及提高SOD，CAT和TrxR酶活性。结论： 一定浓度的PMBE对顺铂所致人胚肾细胞的毒性有保护作用，其机制可能与PMBE的抗氧化性密切相关。

关键词 马尾松树皮提取物；顺铂；人胚肾细胞；肾毒性；抗氧化性

收稿日期 2013-01-16

基金项目 广东省工业攻关计划项目（2004b10401033）；广东省自然科学基金项目（S2012010010533）；中山大学教务处教改项目（100035）

通信作者 *王宏斌，教授，Tel：（020）84039179，E-mail：

作者简介 冯冬茹，博士，E-mail：

顺铂是临床上广泛使用的化疗药物之一，但顺铂严重的肾毒性是限制其临床应用的主要因素，机制可能与其引起的过氧化反应有关[1-2]。近几年的研究表明，抗氧化剂对顺铂的肾毒害有明显的保护作用[3]。马尾松树皮提取物（Pinus massoniana bark extracts，PMBE）的主要活性成分是原花青素，由单体、寡聚体和多聚体等天然类黄酮组成的混合物[4]。本实验室已经证明马尾松树皮提取物具有抗氧化以及清除自由基的能力[5]，但是对其在顺铂肾毒性保护上的应用还未见报道，基于此，本研究以人胚肾细胞HEK293为研究材料，旨在重点研究PMBE是否对顺铂引起的肾毒性具有保护作用，并初步探究其作用机制。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 马尾松树皮提取物（PMBE，由广东省嵩珍营养研究所提供，用DMSO配成100 g·L-1的贮存液，并用0.22 μm的过滤膜过滤，-20 ℃储存。使用前，用10% FBS-DMEM培养液配成不同浓度的处理液）；顺铂（TCI，日本东京化成工业株式会社，纯度>95.0%，用PBS配制溶解后用0.22 μm的过滤膜过滤，密封避光4 ℃保存备用）；人胚肾细胞HEK293（中山大学医学院动物细胞中心）；胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、DMEM、青链霉素和维生素C（Vit C）（Gibco公司）；活性氧（reactive oxygen species，ROS）和过氧化氢酶（catalase，CAT）检测试剂盒（碧云天公司）；NADPH和胰岛素（普博公司）；MTT，DTNB和小鼠肝脏TrxR（Sigma-Aldrich）；E. coli Trx为本实验室从质粒中分离纯化；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 细胞培养 细胞用含10% FBS和1%青链霉素的DMEM培养液培养，置于37 ℃，5% CO2的培养箱中，用0.25%胰蛋白酶消化传代，2～3 d传代1次，以维持细胞处于对数生长期。

1.3 细胞存活率检测实验 顺铂对HEK293细胞的毒性作用：取对数期的细胞，消化后吹打成单细胞悬液，以1×105个/mL接种于96孔板。待细胞生长至融合状态，加入不同浓度顺铂（终浓度分别为0，0.015，0.030，0.060，0.120，0.240，0.480，0.960，1.920，3.840 mmol·L-1）。培养24 h后，每孔加入5 g·L-1的无菌MTT溶液20 μL，继续培养4 h。弃去各孔的培养液，加入150 μL DMSO，200 r·min-1摇床振荡10 min。多功能酶标仪上测定490 nm吸光度（A），每个剂量设6个复孔，实验重复3次。细胞存活率 = A实验/ A空白对照× 100%。

PMBE对HEK293细胞生长的影响：细胞处理方法同1.2项，待细胞生长至融合状态时，加入不同浓度的PMBE（终浓度分别为0，20，40，60，80，100，120，140，160，180 mg·L-1），培养48 h后，同上用MTT法测定吸光度，每个剂量设6个复孔，实验重复3次。

PMBE对顺铂所致HEK293细胞毒性的保护作用：同1.2项，用不同浓度的PMBE培养24 h，弃去处理液，再加入半抑制浓度（IC50）的顺铂处理24 h。用MTT法测定吸光度，每个剂量设6个复孔，实验重复3次。

1.4 各氧化指标检测 取对数期的细胞以1×105个/mL的浓度接种于6孔板，待细胞生长至融合后，加入不同浓度的PMBE（终浓度分别为0，20，40，60，80，100，120，140，160，180 mg·L-1）以及Vit C（100 mg·L-1）培养24 h，弃去处理液，再加入半抑制浓度的顺铂处理24 h。

DCF荧光法测定细胞内ROS水平：细胞培养时采用无酚红的DMEM培养，细胞处理后，参照ROS测定试剂盒说明书操作，弃去培养液，装载DCFH-DA探针，37 ℃孵育50 min，每隔15 min轻摇混匀1次，使得探针与细胞充分接触。孵育结束后，以无血清无酚红DMEM培养液充分洗涤细胞，在多功能酶标仪上使用488 nm激发波长、525 nm发射波长，检测的DCF荧光强度即表征了细胞内的ROS水平。

细胞内MDA和GSH含量，CAT酶活性，SOD酶活性测定：细胞培养结束后，收集6孔板上细胞，制成单细胞悬液，4 000 r·min-1离心5 min收集细胞，去上清，每孔加250 μL PBS，反复冻融4次，4 000 r·min-1离心5 min，取上清液加入试管中，严格按照MDA，GSH，CAT和SOD测定试剂盒所述方法测定[6-7]。

胰岛素还原法测定细胞内TrxR活性：细胞培养结束后，弃去培养液，加入含1 mmol·L-1EDTA的50 mmol·L-1Tris-HCl 缓冲液（pH 7.6），5 000 r·min-1离心8 min收集细胞。冰浴中超声破碎细胞，2 ℃下20 800×g离心30 min收集上清，测定总蛋白浓度[8]。

在冰上，向48孔板中加入85 mmol·L-1 HEPES（pH 7.6），3.5 mmol·L-1 EDTA，0.7 g·L-1 NADPH和2 g·L-1胰岛素，再加入含20 μg蛋白的上清和5 μmol·L-1E. coli Trx，以无菌蒸馏水定容至120 μL，37 ℃孵育25 min后，加入500 μL含0.4 g·L-1 DTNB和6 mol·L-1盐酸胍的0.2 mol·L-1Tris-HCl（pH 8.0）终止反应。在多功能酶标仪上测412 nm吸光度，每个剂量设3个复孔，实验重复3次。通过小鼠肝脏TrxR的已知酶活力和测得的A412绘制标准曲线，1个A412单位指500 μL反应体系中，1 min内使412 nm吸光度最初升高1.00所需的酶量。实验组的A412与标准曲线比对，即可得到样品的TrxR活性[9]。

1.5 统计分析 数据采集和处理采用Microsoft Excel 2007，所有数据均以±s表示。多功能半数致死量软件2.1版Bliss法计算。组间差异性统计采用t检验由SPSS 17.0软件的One-Way ANOVA程序完成。

2 结果

2.1 顺铂对HEK293细胞毒性作用 加入不同浓度的顺铂培养HEK293细胞24 h后，随顺铂剂量增大，HEK293细胞存活率逐渐降低，呈明显的剂量依赖关系，24 h的半数致死浓度（IC50）为（0.093±0.002） mmol·L-1（图1）。表明顺铂对人胚肾细胞HEK293具有明显的毒性。

与空白组相比1）P

图1 顺铂对HEK293细胞的毒性作用

Fig.1 Effects of cisplatin on HEK293 cells viability

2.2 不同浓度的PMBE对HEK293细胞存活率的影响 用不同质量浓度的PMBE（0，20，40，60，80，100，120，140，160，180 mg·L-1）处理HEK293细胞，24 h后检测细胞的存活率。100 mg·L-1以下的PMBE对细胞的生长有促进作用，60 mg·L-1时细胞存活率达到最高；100 mg·L-1及以上质量浓度的PMBE使得细胞存活率下降，细胞存活率仍在90%以上（图2），结果提示，低剂量的PMBE促进细胞的生长，高剂量的PMBE对细胞具有轻微的毒性，抑制了细胞的生长。

图2 不同浓度PMBE对HEK293细胞存活率的影响

Fig.2 Effects of PMBE on HEK293 cells viability

2.3 不同浓度的PMBE对顺铂所致HEK293细胞毒性的影响 不同质量浓度的PMBE（0，20，40，60，80，100，120，140，160，180 mg·L-1）预处理24 h后，再加入顺铂的半数致死浓度（0.093 mmol·L-1）处理24 h，观察PMBE对细胞存活率的影响。与正常组（不加PMBE和顺铂处理）相比较，顺铂模型组（不加PMBE处理）的HEK293细胞存活率明显降低；加入PMBE预保护后，可逐渐提高HEK293细胞的存活率，降低顺铂对HEK293细胞生长的抑制作用（图3）。80 mg·L-1的PMBE使得细胞的存活率升高至最大；随后存活率的提高幅度下降；至高浓度（>140 mg·L-1）时，PMBE对顺铂所致细胞毒性不具有保护作用。

与模型组相比1） P

图3 不同浓度的PMBE对顺铂损伤后HEK293细胞存活率的影响

Fig.3 Effects of PMBE on growth of HEK293 treated by cisplatin

2.4 不同浓度的PMBE对顺铂损伤HEK293细胞内ROS积累的影响 为了确定PMBE保护HEK293细胞免于顺铂氧胁迫作用是否因为减少ROS的产生，用不同浓度的PMBE预保护HEK293细胞，再用顺铂处理，检测细胞内的ROS水平， 以Vit C为阳性对照。顺铂处理后细胞ROS含量升高，至正常组的1.88倍；在低浓度的PMBE预保护下，与顺铂模型组相比，细胞内的ROS含量依次降低，在80 mg·L-1PMBE时，ROS含量降低的程度最大，为模型组的55.52%，低于100 mg·L-1Vit C处理组（降低ROS含量至模型组的77.54%）；大于80 mg·L-1后，ROS含量降低的程度依次降低，到180 mg·L-1时，ROS含量已不再降低，达到模型组的1.02倍（图4）。

图4 不同浓度PMBE预保护后对顺铂损伤后细胞ROS的影响

Fig.4 Effects of PMBE on the ROS content in HEK293 cells impaired by cisplatin

2.5 不同浓度的PMBE对顺铂损伤HEK293细胞MDA，GSH含量的影响 通过对细胞内的MDA，GSH含量进行检测，从脂质过氧化程度，和巯基消耗上来检测PMBE的抗氧化程度。PMBE预保护HEK293细胞24 h后，再用顺铂处理细胞，结果发现顺铂造成细胞GSH水平下调，MDA含量上调，分别为正常对照细胞的75.29%，1.36倍；PMBE低剂量组（质量浓度80 mg·L-1）升高GSH含量，以及下降MDA含量的幅度都减少（图5）。

图5 PMBE预保护后顺铂损伤HEK293细胞GSH，MDA含量变化

Fig.5 Effects of PMBE on the GSH， MDA content in HEK293 cells treated by cisplatin

2.6 不同浓度的PMBE对HEK293细胞内抗氧化系统的酶活性影响 为了确认PMBE能否通过调节抗氧化酶来抑制顺铂引起的氧胁迫，将PMBE预保护HEK293细胞24 h后，接着用顺铂处理细胞，分别检测细胞内CAT酶、SOD酶和TrxR酶活性。发现顺铂造成细胞CAT酶、SOD酶以及TrxR酶活性显著下降，分别下降为正常组细胞的78.91%，57.95%，43.96%；加入PMBE预保护后，可以提高CAT酶、SOD酶和TrxR酶活性，其中SOD和CAT酶活性在80 mg·L-1PMBE时升高程度最大，分别至模型组的1.54倍和1.13倍，大于此浓度后酶活性升高的幅度开始减少，PMBE（质量浓度≥120 mg·L-1）时CAT酶活性不再升高，180 mg·L-1PMBE处理时SOD酶活性不再升高；TrxR酶活性在60 mg·L-1PMBE时升高程度最大，至模型组的1.78倍，PMBE（质量浓度>60 mg·L-1）后酶活性升高的幅度开始减少（图6）。

3 讨论

顺铂具有很强的抗癌作用，临床上用于多种实体肿瘤的治疗，但是顺铂的肾毒性，严重限制了它的临床应用[10]。目前，顺铂所致肾毒性的机制尚未完全阐明。有研究表明，顺铂进入体内在水和代谢过程中可产生大量活性氧自由基，从而引起氧化应激[11]。氧自由基作用于细胞膜及各种细胞器膜，引起脂质过氧化，丙二醛含量升高，肾皮质巯基减少[12]。丙二醛是细胞膜脂质过氧化的终产物，其含量的高低可反映脂质过氧化强度[13]，急性肾损伤中

图6 不同浓度PMBE预保护后对顺铂模型组细胞内抗氧化酶的影响

Fig.6 Effects of PMBE on the antioxidant enzyme activities in HEK293 cells treated by cisplatin

丙二醛含量出现明显升高。谷胱甘肽是非蛋白巯基的一种，肾细胞抵抗各种化学毒物损伤时引起谷胱甘肽的消耗。在国外，对具有调节氧化应激作用的维生素C、维生素E、番茄红素[14]、原花青素[15]、辣椒素[16]、大黄素[17]、槲皮素[18]等在缓解顺铂肾毒性方面进行了研究，结果表明它们能够改善顺铂的肾毒性。

马尾松树皮提取物是一种具有较强的清除活性氧自由基功效和抗氧化能力的生物类黄酮复合物[13]。 本实验室以前的研究中，曾用过氧化氢建立氧化损伤模型，来探究PMBE的抗氧化性，结果表明PMBE可以上调抗氧化酶活性，从而降低机体过氧化损伤的程度，提示PMBE可以进一步开发成具有抗氧化功能的临床辅助药物[5]。

本实验结果表明，顺铂处理组诱导的HEK293细胞毒性递增，细胞内ROS升高，MDA含量升高，GSH含量降低。PMBE高浓度下会产生轻微毒性，小于100 mg·L-1时对HEK293细胞没有毒性。加入不同浓度的PMBE预保护后，低浓度（140 mg·L-1时，对细胞产生毒性叠加效应。本研究提示，适当剂量的PMBE保护人胚肾细胞免受顺铂损伤，是从多个环节发挥其抗氧化能力，不仅能有效清除顺铂引起的氧自由基，还能通过修复抗氧化酶活性，阻止氧自由基的链反应，从而调控机体自由基的平衡，达到保护作用，这就为PMBE的抗氧化应用提供了新领域。

另外，PMBE通过多种途径诱导癌细胞凋亡，与顺铂联合用药，减少顺铂给药剂量，是否有协同作用的增强效应，并减少顺铂不良反应和耐药性发生率，也是值得开展的探究。

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Protective effect of Pinus massoniana bark extracts against cisplatin-

induced nephrotoxicity in human embryonic kidney cells

FENG Dong-ru， DAI Qing-chen， XIE Heng， LI Ruo-da， ZHENG Guang-yao， WANG Jin-fa， WANG Hong-bin（1. State Key Laboratory for Pest control and Resource Utilization， College of Life Sciences，

Sun Yat-sen University， Guangzhou 510275， China；

2. Guangdong Songzhen Nutrition Source Research Institute， Guangzhou 510645， China）

[Abstract] Objective： To investigate the in vitro protective effect of Pinus massoniana bark extracts （PMBE） against cisplatin-induced nephrotoxicity in human embryonic kidney cells （HEK293）， and preliminarily study its mechanism. Method： Human embryonic kidney cells （HEK293） were cultured in vitro. The MTT assay was adopted to test the effect of PMBE and cisplatin on growth of HEK293 cells， and the protective effect of PMBE on cisplatin-induced nephrotoxicity of HEK293， and then detect the intracellular reactive oxygen species （ROS）， malondialdehyde （MDA）， glutathione （GSH） content， catalase （CAT）， superoxide dismutase （SOD） and activity of thioredoxin reductase （TrxR）. Result： PMBE could promote growth of HEK293 cells at low concentrations， but generate slight nephrotoxicity at high concentration. Cisplatin could inhibit growth of HEK293 cells， increase ROS and MDA content， while reducing SOD， CAT and TrxR. The pre-protective PMBE was added to reduce cisplatin′s injury to HEK293 cells， ROS， MDA and GSH content， SOD， CAT and TrxR within certain range. Conclusion： PMBE at specific concentration has the protective effect in cisplatin-induced nephrotoxicity in HEK293 cells. Its mechanism may be related to PMBE′s antioxidant activity.

[Key words] Pinus massoniana bark extract； cisplatin； human embryo kidney cells； nephrotoxicity； antioxidant activity

doi：10.4268/cjcmm20131724