软坚消瘿汤治疗实验性自身免疫性甲状腺炎疗效机制研究

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收稿日期:2009-11-21

基金项目:辽宁省教育厅资助项目(20060543)

作者简介:张兰(1962-),女,教授、主任医师,研究方向:中医药防治甲状腺疾病疗效及机理研究。

摘 要:目的:观察软坚消瘿汤对实验性自身免疫性甲状腺炎(EAT)大鼠的自身抗体、白介素-1、4、6及肿瘤坏死因子-α和甲状腺形态学的影响,从多靶点探讨其作用机制。方法:运用甲状腺球蛋白与弗氏佐剂混合免疫注射法,联合饮用高碘水模拟大鼠实验性自身免疫性甲状腺炎。酶联免疫法检测甲状腺抗体、白介素-1、4、6及肿瘤坏死因子-α水平,HE染色法观察大鼠甲状腺病理改变。结果:软坚消瘿汤能显著降低EAT大鼠自身抗体及相关细胞因子水平,减轻甲状腺滤泡损伤。结论:软坚消瘿汤通过降低EAT血清中自身抗体及细胞因子水平起到减轻甲状腺病理损伤的作用。

关键词:软坚消瘿汤;实验性自身免疫性甲状腺炎;血清抗体;细胞因子;中医实验医学

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)04-0843-03

Effect Mechanism of Ruanjian Xiaoying Decoction on Experimental Autoimmune Thyroiditis

ZHANG Lan,FANG Zhenwei

( The First Affiliated Hospital of Liaoning University of Chinese Medicine,Shenyang 110032,Liaoning,China)

Abstract:Objective:To evaluate the therapeutic effect of Xiaoying Ruanjian Decoction on experimental autoimmune thyroiditis (EAT) from the levels of autoantibodies, interleukin-1,4,6 and tumor necrosis factor-α and the thyroid morphology of EAT rats.To Investigate the effect Mechanism from multiple target point.Methods:An animal model of experimental autoimmune thyroiditis ( EAT) in rats was developed by injecting thyroglobulin mixed with Freund's adjuvant immunization and drinking Periodate water. To detect the levels of autoantibodies, interleukin-1,4,6 and tumor necrosis factor-α with Enzyme-linked immunosorbent assay.To observe the pathological change in the thyroid of rat with HE staining.Results:Ruanjian Xiaoying Decoction significantly reduces the levels of autoantibody, cytokines and the damage of thyroid follicular.Conclusion:Ruanjian Xiaoying Decoction alleviates the pathological injury of thyroid by the suppression of relative expressions of antibodies and cytokines in serum levels.

Key words:Ruanjian Xiaoying Decoction; experimental autoimmune thyroiditis; serum antibody; cytokine; TCM Experimental Medicine

自身免疫性甲状腺炎是常见甲状腺病之一,目前尚缺乏有效治疗措施。软坚消瘿汤是笔者运用中医药理论,总结前辈及自己多年治疗经验创立的治疗本病的中药复方。此方具疏肝行气解郁、活血软坚散结之功,前期临床疗效甚好。早期动物实验研究揭示了其治疗EAT的部分机理,本实验旨在从本方对细胞因子及抗体的影响来探讨其疗效机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级SD雌性大鼠,体重(110±10)g, 4～6周龄,购于沈阳医学院实验动物中心。合格证号:SCXK(辽)2003-0016。

1.2 主要仪器

酶标仪(奥地利)型号:Anthos 2010;37℃电热恒温培养箱(上海博讯医疗设备公司)型号:HXP-9052MBE;离心机(法国Jouan)型号:C4-12;微量移液器(美国热电);电子秤(上海精密仪器有限公司)型号:JY5022。

1.3 主要药品及试剂

1.3.1 造模药品及试剂盒 甲状腺球蛋白(TG)、弗氏佐剂(美国SIGMA公司),甲状腺球蛋白抗体(TGAb)、甲状腺过氧化物酶抗体(TPoAb)、白介素-1、4、6(IL-1、4、6)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等酶联免疫检测试剂盒(美国 ADL公司)。

1.3.2 观察药品 雷公藤多甙片:江美通制药有限公司,购于辽宁中医药大学附属医院药局;软坚消瘿汤中药饮片购于辽宁中医药大学附属医院中草药局。

1.4 方法

1.4.1 动物模型建立及分组

SPF级SD雌性大鼠60只,适应性喂养1周,按体重层次随机取15只为正常组,剩余为造模组。第2周起造模组饮用高碘水浓度为500g/L[1],对照组予蒸馏水。第4周起造模组于双后足皮下多点注射由完全弗氏佐剂(CFA)充分乳化成油包水状的TG(TG∶CFA=1∶1),共两次,中间间隔两天,每次每只含TG100μg[2],作为初次免疫,第5周于后背皮下多点注射由不完全弗氏佐剂(IFA)乳化的TG,每次每只含100μg,每周1次,连续4周,作为加强免疫。第8周结束时成模。将成模后的大鼠随机分为模型组(13只)、雷公藤组(13只)、中药组(14只)。

1.4.2 给药方法

给药剂量按人和动物体表面积折算的等效剂量比值表,计算出大鼠等效灌胃剂量。中药组每只大鼠灌胃软坚消瘿汤量为10mL/(kg•d),生药含量2.03g/mL。雷公藤组予雷公藤多甙片,研磨,温开水配成悬浊液(2.37g/mL)等量灌胃。模型组及正常组灌服等量蒸馏水。4组均每天给药1次,连续6周。

1.5 检测指标及方法

1.5.1甲状腺组织形态学

取大鼠甲状腺,10%的福尔马林固定,石蜡包埋,4μm厚连续切片备用,常规苏木素-伊红(HE)染色。光镜观察甲状腺滤泡形态及内部胶质含量,甲状腺滤泡上皮细胞(TEC)形态,滤泡间淋巴细胞及浆细胞浸润程度。

1.5.2细胞因子及抗体

各组实验大鼠于治疗后第42天腹主动脉取血,离心1500r/min获取血清,采用ELISA检测TGAb,TPOAb,IL-1、4、6及TNF-α。

1.6 统计方法

采用SPSS 13.0统计软件数据分析,数据满足正态性和方差齐性,组间采用方差分析,所列数据采用±s表示。

2 结 果

2.1 甲状腺病理形态学

见图1。正常组:图1A,TEC排列整齐,滤泡呈圆形或椭圆形,大小均匀一致,含胶质丰富,染色淡红色,未见淋巴细胞及浆细胞浸润;模型组:图1B,甲状腺滤泡大量破坏,未破坏者萎缩呈扁平状,大小不一,含胶质较少,染色淡红色,滤泡周围见显著淋巴细胞浸润,滤泡内见浆细胞浸润。雷公藤组:图1C,滤泡内及TEC间有部分淋巴细胞及浆细胞,滤泡形态基本规则,被破坏者少,胶质含量少。软坚消瘿汤组:图1D,滤泡呈低柱状,滤泡形态基本规则,TEC间偶见淋巴细胞浸润,滤泡内未见浆细胞,胶质含量略少,说明中药使甲状腺病理损伤得以修复但未恢复正常水平。

A

B

C

D

图1 甲状腺病理形态(×400)

2.2 各组大鼠血清抗体(±s)比较

见表1。

表1 各组大鼠血清抗体比较

组别nTPOAbTGAb

模型组103.13±0.66384.05±81.82

雷公藤组102.02±0.55#327.22±63.17

中药组101.67±0.34# 273.20±42.73#

正常组101.49±0.40#146.56±39.39#

注:与模型组比较,#P

模型组与正常组比较双抗体明显升高(P

模型组与两治疗组比较TGAb有统计学差异,雷公藤组(P

2.3 各组大鼠血清IL-1 4(±s)比较

见表2。

表2 各组大鼠血清IL-1 4比较

组别nIL-1IL-4

模型组10263.21±62.10470.97±89.78

雷公藤组10193.03±55.58#387.65±97.64

中药组10136.69±55.99#297.62±87.56#

正常组10117.22±35.69#209.04±37.28#

注:与模型组比较,#P

模型组与正常组比较IL-1、4明显升高(P

模型组与两治疗组比较IL-4有统计学意义,雷公藤组(P

2.4 各组大鼠血清IL-6 TNF-α含量(±s)比较

见表3。

表3 各组大鼠血清IL-6 TNF-α含量比较

组别nIL-6TNF-α

模型组10107.02±21.8258.76±10.76

雷公藤组1090.61±15.0751.26±6.05

中药组1061.95±13.48#49.52±8.02

正常组1054.29±15.03#45.44±7.35#

注:与模型组比较,#P

模型组与正常组比较血清IL-6、TNF-α明显升高(P

模型组与两治疗组比较IL-6有统计学意义,雷公藤组(P

模型组与两治疗组比较TNF-α有统计意义均(P0.05)。说明治疗组可降低TNF-α水平。

3 讨论

3.1 TPOAb TGAb与EAT

大量临床和实验研究表明,高TPOAb、TGAb是桥本病诊断和预测预后的主要指标,降低抗体在血清中的水平在控制本病向甲减发展中有重要意义。高水平的TPOAb可与NK细胞作用对TEC产生直接杀伤作用,另外TPOAb在TEC基底膜补体复合物的固定和激活过程中起主要介导作用,在反应过程中甲状腺功能受到破坏。TGAb在抗体依赖性细胞毒中起重要介导作用,其可与TG结合致使甲状腺素释放减少,因此降低双抗体水平在治疗桥本病中成为基本措施。实验结果显示,模型组较正常对照组抗体水平明显升高,故从抗体水平观察模型建立符合实验标准。软坚消瘿汤组疗后抗体显著降低,基本接近正常。本实验数据显示软坚消瘿汤及雷公藤均可降低血清中双抗体水平,但中药疗效明显优于雷公藤,由此推测软坚消瘿汤在治疗桥本病的机理中,可能与降低TPOAb、TGAb水平有关。

3.2 血清IL-1 4 6及TNF-α与EAT

本病发病过程中细胞免疫起重要作用,甲状腺细胞和淋巴细胞释放大量细胞因子使本病进一步恶化。TEC细胞代谢损伤后释放高水平的IL-1、6[3],,且IL-1可以上调凋亡相关蛋白水平,研究认为IL- 6 可以作为甲状腺细胞损害的指标[4],故此两种细胞因子血清中水平高低与病情的控制密切相关。IL-1、6、TNF-α可以促进单核细胞及T细胞进入甲状腺组织,且IL-1及TNF-α可加强TEC与T细胞的结合,并同其他细胞因子共同构成复杂细胞因子网络[5]。IL-6升高使得B细胞产生抗体数量增加,IL-4、6高水平存在促使B细胞向浆细胞分化,从而导致甲状腺滤泡上皮细胞的破坏。实验结果显示:软坚消瘿汤组与模型组比较IL-1、4、6及 TNF-α水平均明显下降,基本接近正常。本实验结果表明治疗组对四种细胞因子升高有较好抑制作用,但中药组在降低细胞因子中更具优势,故实验证实软坚消瘿汤治疗桥本病的第二个机理,可能与显著降低细胞因子水平有关。

3.3 软坚消瘿汤治疗EAT机制探讨

本病是体液免疫和细胞免疫共同参与的细胞损伤过程,二者相互影响,模型组病理切片广泛存在淋巴细胞和部分浆细胞浸润,TEC破坏中抗体介导的细胞毒起了重要作用,且高抗体使得NK细胞杀伤作用得到加强,并吸引大量淋巴细胞侵袭TEC,可以推测TEC和淋巴细胞释放大量细胞因子而加强了细胞免疫过程。因软坚消瘿汤显著降低TPOAb,TGAb,及IL-1、4、6,和TNF-α水平,可推测软坚消瘿汤治疗本病的机制可能与调节体液免疫和细胞免疫有关。

参考文献

[1] 石佩,崔玉玲.高碘和甲状腺球蛋白诱发实验性自身免疫性甲状腺炎的研究[J].长治医学院学报,2006,20(1):12-13.

[2] 孙崴,宋光华,贺斌. 碘和甲状腺球蛋白诱导大鼠实验性自身免疫性甲状腺炎的研究[J] .中华内科杂志,2000,39 (12):841.

[3] 白耀.甲状腺病学-基础与临床[M].北京:科学技术文献出版社,2003:158.

[4] Bartlena L, Brogioni S, Grasso L, et al.Interleukin- 6: a marker of thyroid- destructive processes [J].Clin Endocrinol Metab,1994,2( 6):537.

[5] 刘新民.实用内分泌学[M].北京:人民军医出版社,2004:271.