华蟾素调控VEGF/VEGFR-2信号传导抑制肿瘤血管生成的研究
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摘 要：目的：探讨华蟾素注射液对肿瘤血管生成影响及其调控相关信号传导的分子机制。方法：采用Lewis肺癌荷瘤小鼠随机分为生理盐水组（阴性对照组）,参一组（阳性对照组）,华蟾素组，观察荷瘤小鼠肿瘤抑制率，瘤内微血管密度；采用免疫组化法检测vegf表达；采用Western Blotting法检测人脐静脉血管内皮细胞vegfr-2（KDR）表达。结果：华蟾素的抑瘤率在12％～31％；华蟾素能减少瘤内血管密度、降低瘤内VEGF表达及血管内皮细胞膜上VEGFR-2蛋白表达，华蟾素组与生理盐水组比较有显著差异（P
中图分类号：R285.5
文献标识码：A文章编号：
1673-7717（2008）11-2489-03
Mechanism Investigation of Huachansu in Regulating Signal Transduction of Tumor Angiogenesis
LIU Hao，LIN Hongsheng，HUA Baojin，LU Wenping
（Gang'anmen Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100053,China
）
Abstract：Objective:To investigate the effect of Huachansu(HCS) on angiogenesis and the mechanism of which is regulation in signal transduction.Methods:Mice transplanted with Lewis lung cells were randomly divided into saline group (negative control), Rg3 group (positive control) and HCS group. The tumor inhibition rate and the quantity of microvessel density were observed; The expression of VEGF of implanted tumor of mice was tested by immunohistochemistry . The expression of VEGFR-2 of HUVECs was tested by western blotting method.Results:The results showed the tumor inhibited rates of HCS were 12%~31%. HCS reduced the quantity of microvessel density in tumor and lowered the expression of VEGF of tumor and VEGFR-2 ofHUVECs,HCS group was lower than those in the saline group, significant difference was shown in comparison with those in the saline group (P
Key words：HCS injection;angiogenesis;signal transduction;VEGF
华蟾素注射液（HCS injection）是临床常用的治疗肿瘤中药注射剂，应用广泛，疗效确切，对其抗肿瘤作用以往有许多报道[1-2]，但在肿瘤血管生成方面尚未涉及。本文旨在探讨华蟾素对肿瘤血管生成作用及其信号传导机制的影响。
1材料
C57BL/6J纯系小鼠，购自中国医学科学院实验动物中心；Lewis肺癌瘤株购自中国医学科学院药物研究所；人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)株购自Cascade Biologics 公司；华蟾素注射液由安徽金蟾药业公司提供；参一胶囊（Rg3）由吉林亚泰药业公司提供；CD34免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司；血管内皮细胞生长因子（VEGF）免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司；兔抗血管内皮细胞生长因子受体－2（VEGFR-2，KDR）购自Oncogene公司。
2方法
2.1体内实验
2.1.1造模制备Lewis肺癌荷瘤小鼠，剥离瘤组织，选取生长良好的肿块，按肿瘤（g）：生理盐水（mL）为1：3比例匀浆，调细胞数为2×106/mL。选取6～8周龄健康C57BL/6J小鼠，每只小鼠右侧腋窝皮下接种0.2mL。
2.1.2分组与给药取C57BL/6J纯系小鼠50只 ,雌雄各半，随机分为5组,每组10只。其中除生理盐水组（阴性对照组，20mL•kg-1•d-1）,参一组（阳性对照组，20mg•kg-1•d 1）外,华蟾素设40、20、10mL•kg-1•d-1高中低3个剂量组。
2.1.3观察指标（1）肿瘤抑制率。从接种次日起每日给药1次,共给药10天。接种11日后,脱颈处死动物,解剖取瘤块,比较各剂量组瘤重,结果判定根据以下公式计算:
肿瘤抑制率%=对照组平均瘤重-给药组平均瘤重对照组平均瘤重×100%
（2）瘤内血管密度。采用CD34单抗标记肿瘤组织观察肿瘤血管的发育程度。取一定量瘤组织，用10％中尔马林固定，脱水；载玻片防脱片预处理用；冰冻切片机切成5μm的切片，室温风扇吹干；纯丙酮室温固定10～30min，蒸馏水洗，干燥后冰冻保存；3％H2O2入室温孵育10min，以去除内源性过氧化物酶；PBS冲洗5min×3次；滴加复合溶化液，室温孵育10min。蒸馏水洗2min×3次；滴加正常山羊血清，室温10min。甩去多余液体，不洗；滴加兔抗CD34抗体，37℃孵育2h后，0．1M PBS洗，2min×3次；滴加生物素化山羊抗兔 IgG，37℃孵育20min，0．1M PBS洗，2min×3次滴加链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（SABC）37℃孵育20min，0．1M PBS洗5 min×4次；DAB显色，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤；0．2％亮绿轻度复染，脱水，透明，封片。
结果判定标准：血管内皮细胞表面CD34阳性被染成棕黄色。由血管内皮细胞形成的条状、隙状等孤立或簇状结构并有管腔，且管腔小于8个细胞大小者为1条血管；相互分离的血管内皮细胞但无明显管腔亦按1条血管计数。血管腔大于8个细胞或管壁可见平滑肌者不计入内。
微血管密度计数方法：先在低倍镜下（100倍）确定3个CD34阳性着色最密集的区域，然后在高倍视野（200倍）下计数微血管，取3个视野的均值作为微血管密度(MVD)。肿瘤内硬化区域和肿瘤细胞稀少区域内的微血管不进行计数。
（3）免疫组化法检测VEGF表达。采用免疫组化(SABC)法检测瘤组织VEGF表达，实验方法同上。结果判定：VEGF表达定位于肿瘤细胞胞浆与胞外，呈棕黄色细颗粒状。将染色结果用Image-Pro Plus4．5图像分析软件进行分析，每1切片在200倍视野下随机选择5处，计算阳性区域平均光密度值。平均光密度值(mean optical density， MOD)=积分光密度值(integrated optical density，IOD)/面积(area)，所有数据取均值并分析统计。
2.2 体外实验
2.2.1 细胞处理取处于4～6代人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）接种传代，培养24h后，分为5组，除正常组直接加入生理盐水外，其余均加入4ng/mL VEGF，同时分别加入生理盐水，参一胶囊100μg/mL、华蟾素0.1μg/mL，即正常组（N.S组）、对照组（N.S+VEGF组）、参一组（Rg3+VEGF组）、华蟾素组（HCS+VEGF组）。上述各组孵育48h后，PBS冲洗1遍，胰酶消化，用冷PBS中和后，离心洗2遍，放置-80℃冰箱保存。
2.2.2Western Blotting法检测VEGFR-2（KDR）表达 Western Blotting步骤根据参照文献[3]包括：（1）膜蛋白提取；（2）蛋白质电泳；（3）电转膜、杂交；（4）暗室中X光片曝光2h；（5）X光片显影、定影。
2.2.3图像处理及统计分析用Image-Pro Plus4．5图像分析软件测定Western blot条带的净OD值（Net Intensity，NI）以各泳道条带OD值与对应的β-Actin组条带OD值的比值（相对OD值）来计算检测蛋白的表达量。各组数据采用±ｓ表示，采用ｔ检验，应用SPSS10.0统计软件分析。以P
3结果
3.1华蟾素对Lewis小鼠的抑瘤作用
见表1。
表1实验结果显示：参一组可增加Lewis小鼠体重，与生理盐水组比较差异明显（P0．05）；华蟾素高、中剂量组、参一组对Lewis小鼠瘤体有一定的抑制作用，与生理盐水组比较差异明显（P
3.2华蟾素对Lewis小鼠瘤内微血管密度的影响
见表2。
瘤内血管密度（MVD）是反映药物对肿瘤血管抑制程度的直接指标。CD34是血管内皮细胞的特异性抗原，采用CD34单抗标记肿瘤组织可以清楚的观察到肿瘤组织的血管发育程度。免疫组化实验结果显示：华蟾素组、参一组能明显降低肿瘤组织的微血管密度（MVD），与生理盐水组比较差异明显（P＜0.05）；其中华蟾素高、中、低剂量组分别为22.34±6.54、26.32±4.48、30.56±0.46。上述结果证明：华蟾素对荷瘤小鼠肿瘤血管具有一定的抑制作用。
3.3 华蟾素对Lewis小鼠瘤组织VEGF表达的影响
见表3。
表3 华蟾素对Lewis小鼠瘤组织VEGF表达影响（±s）
VEGF是已知作用最强的血管内皮细胞增殖促进剂。肿瘤组织通过分泌大量VEGF促进肿瘤血管生成。VEGF定位于肿瘤细胞浆与胞外，呈棕黄色细颗粒状。应用免疫组化方法检测结果显示：华蟾素组、参一组能明显降低荷瘤小鼠瘤组织中VEGF表达，与生理盐水组比较差异明显（P＜0.05）。其中华蟾素高、中、低剂量组的平均光密度值分别为3.47±1.08、4.08±1.65、6.22±1.06。
3.4 华蟾素对血管内皮细胞VEGFR-2（KDR）蛋白表达的影响
见图1、图2。
VEGFR位于血管内皮细胞膜上，其亚型VEGFR-2（KDR）与血管内皮细胞增殖有关，VEGF可激活VEGFR-2（KDR）使其大量表达。采用Western blotting方法检测结果显示：血管内皮细胞膜中VEGFR-2蛋白表达对照组与正常组比较明显增加，两组差异明显（P
4讨论
华蟾素是临床常用的治疗肿瘤中药注射剂，从中华大蟾蜍之阴干全皮提取制成，具有止痛消肿，解毒抗癌功效。在肿瘤治疗中，华蟾素应用广泛，疗效确切，以往有许多报道[1-2]，但其对肿瘤血管生成及其机制的影响尚未见报道。
研究显示：肿瘤生长与肿瘤血管生成关系密切。当肿瘤的体积达到2～3mm3以上时就必须依赖新生血管为其继续增殖提供必需的氧气和营养物质。因此理论上讲，抑制肿瘤血管生成就会切断肿瘤的营养供给的重要通路[4-5]。目前，以肿瘤血管为靶点的研究已引起学术界的广泛关注。
肿瘤血管生成是一个多因素参与、多步骤复杂的过程。在生理状态下，人体内的血管生成因子和血管生成抑制因子保持相对平衡，血管处于静止状态。在肿瘤组织中因微环境的改变（如缺O2状态）以及癌基因表达可以诱使肿瘤细胞分泌大量VEGF，从而启动“血管生成开关”[6]。VEGF属于血小板源性内皮生长因子（PDGF）家族一员，是一种高度特异的血管内皮细胞有丝分裂素，能选择性增强血管内皮细胞有丝分裂，刺激内皮细胞增殖，促进血管生成，但VEGF的上述功能必须与血管内皮细胞膜上的相应受体结合才能实现。VEGF受体（VEGFR）位于血管内皮细胞膜上，有3种亚型，即VEGFR-1（flt-1）、VEGFR-2（flk/KDR）和VEGFR-3（flt-4），它们均由含7个免疫球蛋白样结构组成的细胞外区、膜区及酪氨酸激酶区，属于跨膜受体，其共同特点是催化域内有酪氨酸激酶插入区，该酪氨酸激酶的活性通过受体和配体结合而激活，在细胞增殖和分化中发挥重要作用。VEGF受体各亚型的功能有所不同，KDR主要与调控血管生成有关，在血管内皮细胞增殖中的大量表达。Flt-1主要与胚胎早期血管形成和伤口愈合有关，在内皮细胞排列成管腔时发挥主要作用。Flt-4与淋巴管的形成有关，因此VEGF/VEGFR-2构成调控肿瘤血管生成的关键信号传导途径[7]。
本实验结果显示：华蟾素能抑制Lewis肺癌小鼠肿瘤生长，减少瘤内血管密度（MVD），抑制肿瘤血管生成，进一步研究发现，其作用机制与华蟾素降低瘤内VEGF及血管内皮细胞膜上VEGFR-2（KDR）蛋白表达，调控与肿瘤血管生成的有关的信号传导有关。中医药治疗肿瘤历史悠久，近年来日益成为肿瘤综合治疗的重要组成部分。与化疗药物有明显不同，中药具有多部位、多靶点的整体调节作用。抑制肿瘤血管生成为探讨中药作用机制提供了一个新思路，深入开展相关研究对丰富中医抗肿瘤理论，提高临床水平，促进中医药现代化是一项有益的探索。
参考文献
[1] 林宇，付鉴，陈晓伟，等.华蟾素对肺癌抗癌作用的影响［J］.广州中医药大学学报,2003,20(1):69-71.
[2] 关钧.华蟾素抗肿瘤作用机理的初步探讨［J］.蚌埠医学院学报，1993，18(2)：78.
[3] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T.分子克隆实验指南[M].北京:科学出版社,1992：852-898.
[4] Folkman J.Angiogenesis in cancer,vascular,rheumatoid and other disease［J］.Nature Med，1995，22(1)：27.
[5] Folkman J.Anti-angiogenesis:new concept for thery of therapy of soild tumors［J］. Aun Surg,1972,175(3):409-416.
[6] Veikkola T, Karkkainen M, Claessorr Welsh L, et al. Regulation of angiogenesis via vascular endothelial growth factor receptors［J］. Cancer Res, 2000,60(2): 203-212.
[7] 姜自彬,李元.血管内皮生长因子受体的研究进展［J］.国外医学•药学分册,2001,28(1):9-13.
注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”