Gαi2对脑缺血—再灌注后神经细胞凋亡的影响
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇Gαi2对脑缺血—再灌注后神经细胞凋亡的影响范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
【摘要】目的 探讨分析抑制性G蛋白α2亚单位（Gαi2）在大鼠脑缺血-再灌注损伤模型海马中的表达及其对神经细胞内钙离子浓度和凋亡的影响。方法 将90只SD大鼠随机（随机数字法）分为假手术组（SS组，n=30）、脑缺血-再灌注损伤组（IR组，n=30）。脑缺血-再灌注且脑室内微量灌注Gαi2活性抑制剂百日咳毒素（PT）组（PT组，n=30）；用免疫组化、Western blotting分别测定大鼠脑缺血-再灌注后6 h、12 h、24 h各组中海马神经内Gαi2的表达，采用流式细胞术测定各组中海马细胞内游离Ca2+浓度的平均荧光值，TUNEL法检测神经元细胞的凋亡。结果 不同时间点，IR组Gαi2含量和Ca2+浓度较SS组明显增高（P
【关键词】抑制性G蛋白α2亚单位；脑缺血-再灌注损伤；海马；百日咳毒素；凋亡；神经细胞；钙离子；死亡
The effect of Gαi2 on neuronal apoptosis in cerebral ischemia-reperfusion injury model of rats LI Jian， LIU Peng， LIAO Yi-liu.Department of Traumatic Surgery， Tongji Hospital， Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology， Wuhan 430030，China
Corresponding author：LIAO Yi-liu， Email：
【Abstract】Objective To discuss the levels of inhibitory protein Ga-2（Gαi2） in hippocampus of brain and the effects of Gαi2 on neuronal intracellular Ca2+ level in cerebral ischemia reperfusion injury model of rats. Methods Ninety SD rats were randomly（random number） assigned to sham group （n=30）， ischemic-reperfusion （IR） group （n=30）， Pertussis toxin （PT） group （n=30）. The blood flow of right common carotid artery of rat was blocked for 90 min to make ischemia reperfusion model. The levels of Gαi2 in hippocampus was assayed by immunohistochemistry and Western blotting after ischemia reperfu-sion for 6，12，24 h in each group. The average fluorescence values of intracellular Ca2+ levels in hippocampus of rats in three groups were detected by using Flow CytoMeter （FCM）. Neuronal cell apoptosis was measured by TUNEL.Results After restoration of middle cerebral artery blood flow for different lengths of time， the levels of hippocampus Gαi2 and Ca2+ levels in IR group were significantly higher than those in Sham group （P
【Key words】Gαi2；Cerebral ischemia reperfusion injury；Hippocampus；Pertussis toxin；Apoptosis；Neuron；Ca2+；Death
脑缺血-再灌注损伤机制中，细胞内钙超载被认为是细胞死亡的最后共同通路，它促发多种病理损害过程，如炎症、自由基的形成、膜降解、线粒体功能紊乱等，最终介导细胞不可逆性死亡[1]。G蛋白 （G protein）是一种在质膜蛋白中广泛存在的信号转导蛋白，其表达水平及活性的变化相应地调节着细胞生理、生化以及相应基因的表达，在细胞信号转导过程中起着“分子开关”的作用[2-3]。G 蛋白依其结构和功能主要分为刺激性G蛋白（Gs）和抑制性G蛋白（Gi）。抑制性G蛋白α亚单位（Gαi）有3个亚型，即Gαi1、Gαi2和Gαi3。Gαi2具有抑制腺苷酸环化酶（AC）活性作用，与磷脂酶C依赖的磷酸肌醇脂水解、钾通道激活和调节Ca2+通道开放有关。心脏的兴奋收缩偶联中，Gi蛋白介导的信号机制调节钙离子通道。在Gαi2基因敲除和Gαi2蛋白抑制的大鼠中，心肌缺血损伤更严重[2，4]。本实验旨在研究大鼠脑缺血-再灌注损伤中Gαi2的表达变化和对神经细胞内钙离子浓度和细胞凋亡的影响。
1 材料与方法
1.1 试剂及仪器
百日咳毒素（pertussis toxin，PT）、抗Gαi2抗体购自sigma公司，Fluo-3AM钙离子试剂盒购自碧云天公司，流式细胞仪（BECKMANFC500 MPL）。
1.2 动物模型制作及分组
普通级健康雄性SD大鼠90只，体质量200～250 g，由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供。10%水合氯醛按0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，颈正中切口，暴露右侧颈总及颈内外动脉，在距颈总动脉叉1 cm处及远心端结扎颈外动脉并于中间剪断颈外动脉。动脉夹夹闭颈总动脉，于颈外动脉结扎处近心端0.5 cm处剪一切口，将一端稍膨大尼龙线蘸取肝素，由颈外动脉切口向颈内动脉插入至（20±1.5）mm有轻微阻力感停止，颈外动脉游离端近切口处结扎固定线栓，消毒缝合皮肤，并将线栓尾端留置于体外。缺血90 min后，向外抽线栓，使其头端沿颈内动脉回到颈外动脉主干中，恢复大脑中动脉血流。将实验动物随机分为3组，每组27只，各组动物模型建立成功后按再灌注时长分为6、12、24 h 3个亚组，其中PT组为造模前于前囟向后0.8 mm中线旁开1.5 mm处，钻开颅骨并挑破硬脑膜后，用微量注射器垂直进针3.8 mm，于右侧侧脑室内灌注Gαi2活性抑制剂百日咳毒素PT 10 μg/kg，IR组则右侧侧脑室给予等量生理盐水， 假手术组仅暴露三条颈动脉，到相应时间点处死取海马组织。
1.3 测定指标
1.3.1 Gαi2蛋白测定 取海马区脑组织，免疫组化法（SABC法）染色Gαi2蛋白。取适量RIPA裂解液匀浆海马组织，测蛋白浓度后，各样品取50 μg/总蛋白上样电泳，行Western blotting。
1.3.2 细胞内游离Ca2+ 浓度测定 大鼠断头处死后冰盘上迅速取脑组织海马区，碎成1 mm的小块，0.25%胰蛋白酶在37.0℃水浴箱中消化后，200 目尼龙网过滤去除细胞团块，离心（1000 r/min，5 min），弃上清，PBS重悬细胞，加入Fluo-3AM-DMSO标记，流式细胞仪测其荧光值。
1.3.3 细胞凋亡测定 大鼠海马组织TUNEL染色，测定神经细胞凋亡率。
1.4 统计学方法
应用SPSS 13.0统计软件分析，数据以均数±标准差（x±s）表示，单因素方差分析（one-way ANOVA）， SNK-q检验 进行两两比较，以P
2 结果
2.1 Gαi2蛋白表达采用免疫组化方法对脑缺血-再灌注损伤模型脑内Gαi2表达进行检测，IR组Gαi2蛋白表达明显增多，见图1。
2.2 Western blotting
相对应时间点，IR组中Gαi2表达量显著高于SS组（P0.05）。见图2和图3。
2.3 Ca2+ 浓度
SS组6 h，12 h，24 h海马细胞内游离Ca2+浓度平均荧光值X-mean值分别为1.132±0.463、1.096±0.302、1.072±0.382，IR组中相对应时间点平均荧光值显著高于SS组（P
2.4 细胞凋亡
TUNEL染色阳性为细胞呈棕黄色颗粒（图6），随再灌注时间延长，IR组和PT组的凋亡细胞数逐渐增加；相对应时间点，PT组神经细胞凋亡数较IR组升高（P
3 讨论
在脑缺血-再灌注损伤过程中，细胞内外Na+/ Ca2+交换异常，钙泵（Ca2+-ATPase）数量及活性下降，炎性反应和大量的自由基损伤生物膜使膜通透性增大及线粒体结构功能障碍等，这一系列的变化将导致神经细胞内Ca2+升高。当Ca2+内流过多和/或胞内线粒体及内质网储存Ca2+释放入胞浆过多时，将引发神经细胞内钙超载 [5-7]。钙超载发生后，一方面线粒体摄取细胞内钙使胞浆内钙向线粒体转移，然而过多的Ca2+与线粒体内含磷酸根的化合物结合形成不可溶性磷酸钙，干扰线粒体的氧化磷酸化，使ATP生成减少[8]。同时Ca2+也可与通透性转运孔相结合，导致线粒体肿胀，功能失调，引起神经细胞死亡或凋亡。另一方面，细胞内游离钙增加，可激活多种钙依赖性的酶促蛋白，包括磷酸二酯酶、腺苷酸环化酶（AC）、CaM依赖性蛋白激酶（CaMPK），通过基质水解，损伤细胞膜，促进自由基生成、激活非选择性离子通道等途径产生细胞毒性作用引起神经元功能和结构完整性的破坏，最终导致细胞死亡或者凋亡[9-12]。
目前对于Gαi2在脑缺血-再灌注损伤中的作用还未完全阐明，本组实验结果表明，在大鼠脑缺血-再灌注损伤模型中，脑缺血-再灌注组（IR组）Gαi2蛋白表达较SS组明显增高（P
Gi家族的蛋白能与GPCRs相互作用，被认为是一个非常重要的药物靶向蛋白[13]。在中枢神经系统中，Gαi2的含量比较高。Gi可抑制腺甘酸环化酶活性，降低细胞内环磷腺苷（cAMP）含量，维持细胞功能和结构的稳定，且Gi可抑制N和P/Q型钙通道。对Gαi2基因敲除鼠的离体研究表明，在外周组织中，Gαi2通过对AC和钙离子通道的调节而介导神经递质的释放[14-15]。最近有人用脑室内灌注Gαi2的反义寡核苷酸链，可以造成脑室扩张[13]。陈莹莹和夏强[16]对缺血心肌细胞的研究认为，Gi/o蛋白可能通过PLC/PLD（磷脂酶D/磷脂酶C）激活蛋白激酶C（PKC）。PKC一方面增强PLD的活性，持续激活PKC，另一方面抑制PLC对肌醇磷酸的水解，并促进三磷酸肌醇（IP3）的降解，减少细胞内Ca2+浓度的异常升高，从而对缺血心肌细胞起到一定的保护作用。另有研究表明[17-19]，Gαi2能够介导大鼠心肌缺血性损伤过程中的心肌保护作用。在中枢神经系统，我们的实验结果表明Gαi2对缺血的神经细胞也具有保护作用，且这种作用很可能是通过抑制细胞内钙离子的异常升高来实现的。钙离子拮抗剂对脑缺血损伤具有保护作用，尼卡地平联合异丙酚预处理能减少沙鼠缺血后再灌注神经细胞的凋亡[20]。
参考文献
[1]Vannucci RC， Brucklacher RM， Vannucci SJ. In tracellular calcium accumulation during the evolution of hypoxic-ischemic brain damage in the immature rat [J].Brain Res Dev Bra in Res， 2001， 126 （1）：117-120.
[2] Raymoond JR. Multiple mechanisms of receptors G protein signaling specifity[J].Am J Physiol， 1995， 269 （2）：141-158.
[3] 孙耕耘，王应灯. G蛋白偶联受体激酶2参与血小板活化因子致肺微血管内皮细胞损伤的机制[J]. 中华急诊医学杂志，2004，13（9）：602-605.
[4] Martini， Philip W， Raake J， et al. Targeted Inhibition of Cardiomyocyte Gi Signaling Enhances Susceptibility to Apoptotic Cell Death in Response to Ischemic Stress [J].Circulation， 2008， 117：1378-1387.
[5] 郭志凌， 赵华月， 郑信华. 局限缺血-再灌注心肌细胞内钙超负荷发生机制的探讨[J]. 同济医科大学学报， 1995， 24（3）：198-201.
[6] Mochizuki S， Jiang C. Na+/Ca2+exchanger and myocardial ischemia/reperfusion [J].Jpn Heart J， 1998， 39（6）：707- 714.
[7] Makrs AR. Intracellular calcium-release channels： regulators of cell life and death [J]. Am J Physiol， 1997， 272（597）：113-178.
[8] Tang XH， Gao J， Fang F， et al. Hepatoprotection of oleanolic acid is related to its inhibition on mitochondrialpermeability transition[J]. Am J Chin Med， 2005， 33： 627-637.
[9]杨光田，陈齐国，汤彦. 一氧化氮和Ca2+含量对缺血-再灌注大鼠脑细胞凋亡的影响[J].微循环学杂志，2005， 15 （3）：5-7.
[10] 陶祥洛. 颅脑损伤[J].中华急诊医学杂志，2001，12（3）：142-143.
[11] Zhang C， Shen W， Zhang G. N-methy1-D-aspartate receptor and L-type voltage-gated Ca2+channel antagonists suppress the release of cytochrome c and the expression of procaspase-3 in rat hippocampus after global brain ischemia [J]. Neurosci Lett， 2002，328（3）：265-268.
[12] Frantseva MV， Carlen PL， Perez Velazquez JL. Dynamics of intracellular calcium and free radical production during ischemia in pyramidal neurons [J]. Free Radic Biol Med，2001，31（10）：1216-1227.
[13]Mnkknen KS， Hakumki JM， Hirst RA， et al. Intracerebroventricular antisense knockdown of Gαi2 results in ciliary stasis and ventricular dilatation in the rat[J].BMC Neuroscience，2007， 8：26.
[14] Rudolph U， Spicher K， Birnbaumer L. Adenylyl cyclase inhibition and altered G protein subunit expression and ADP-ribosylation patterns in tissues and cells from Gi2 alpha-/-mice[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，1996， 93（8）：3209-3214.
[15] Chen F， Spicher K， Jiang M， et al. Lack of muscarinic regulation of Ca2+channels in Gi2 alpha gene knockout mouse hearts[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2001， 280（5）：H1989-1995.
[16]陈莹莹，夏强. Gi/o蛋白介导的信息转导通路在低氧预处理心肌保护中的作用[J]. 生理学报，2000，52（2）：93-97.
[17]Ohyanagi M，Keli HU， Stanley N. Mechanisms of ischemic pre-conditioning in rat hearts： Involvement of α1β-adrenoceptors， pertussis toxin-sensitive G proteins， and protein kinase C [J] . Circulation，1995，92 ： 2259.
[18] Dizayee S， Kaestner S， Kuck F， et al.Gαi2- and Gαi3- specific regulation of voltage-dependent L-type calcium channels in cardiomyocytes [J]. PLoS ONE，2011，6（9）： e24979.
[19] Rachael EW， Corbin GT， Nathaniel WM， et al. Gαi2 -mediated protection from ischaemic injury is modulated by endogenous RGS proteins in the mouse heart [J]. Cardiovascular Research，2011， 91：45-52.
[20]王屹，柳子明，周海燕. 尼卡地平联合异丙酚预处理对沙鼠缺血后再灌注神经细胞凋亡的影响[J]. 中华急诊医学杂志，2003， 12（5）：312-314.
（收稿日期：2012-04-26）
DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2012.12.002
基金项目：教育部留学回国人员科研启动基金资助项目（2009-1001）；湖北省自然科学基金资助项目（2011CDB543）
作者单位：430030 武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院创伤外科
通信作者：廖忆刘，Email：
中华急诊医学杂志2012年12月第21卷第12期Chin J Emerg Med，November 2012，Vol.21，No.12
P1303-P1307