大鼠膈神经放电记录的实验综述报告

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摘要：膈神经放电可反映呼吸运动状态及呼吸中枢的电活动，通过大鼠膈神经放电记录实验可使学生系统深入地理解呼吸生理，培养学生综合分析和解决问题的能力。本文从膈神经放电记录的详细过程、注意事项及实验体会，系统展开综述报告，为教学及科研需要而进行的该类实验提供参考。

关键词：膈神经放电；实验；综述报告

膈肌是重要的吸气肌[1]，膈神经作为膈肌唯一的传出神经便成为观察呼吸效应的一个最重要的神经结构，同时，膈神经电活动与呼吸中枢电活动密切相关，二者活动变化一致[]，由此可根据膈神经放电活动来反应呼吸中枢神经元放电活动情况，为呼吸相关的科学研究和实验教学提供客观指标。

1大鼠膈神经放电记录实验的意义

大鼠是基础科学研究中最常用的啮齿类小动物，其90%以上的基因与人类相匹配，市场有现成的针对大鼠的各种生物抗体，研究方便，且大鼠最易于长时间饲养和检测肺通气功能，便于模拟慢性肺疾病模型，尤其大鼠价格较大动物便宜，可大大降低实验成本，增加更多学生实践动手的机会。记录大鼠膈神经的放电，是项动脑动手能力等要求较高的电生理实验技术，该实验能为学生提供一个综合而系统的学习锻炼平台，使其能观察到呼吸运动的中枢调节过程，了解呼吸运动的电生理记录方法，从而更深入地理解呼吸的本质。通过系统的实验过程，能提高学生分析问题和解决问题的综合能力，更能激发学生的求知欲，开拓其思路，启发其创新性思维。

2膈神经放电的记录过程和步骤

2.1 动物麻醉 使用3%戊巴比妥钠对Sprague Dawley大鼠（300±20g）进行腹腔注射麻醉，以麻醉程度较深为宜（用镊子夹大鼠前后肢均无痛觉反射，呼吸由胸式转为腹式呼吸）。若实验过程中大鼠麻醉程度降低，可酌量追加麻药。

2.2 气管插管 大鼠麻醉后仰卧，剔除颈部鼠毛，用碘酒进行消毒，在颈部中线处剪开约1cm小切口，用玻璃分针沿肌缝做钝性分离，分开筋膜后可见相对较大的甲状腺，仔细游离甲状腺与周围组织，尽量避免损伤血管。再用血管钳分开颈前肌群，即见白色、有环形软骨的气管。一手固定气管，另一手用剪刀将气管剪出倒T形切口，顺气管向前下方轻轻送入事先备好的与气管直径匹配的干净插管，并用丝线结扎固定，防止脱落。

2.3 分离膈神经 分离膈神经是记录膈神经放电的前提，是整个实验过程的关键环节，直接影响实验的成败，因为大鼠的膈神经比家兔的更细，对做惯了家兔实验的大多同学来讲，此步更是实验的难点。具体包含以下步骤：①动物仰卧和分离颈前肌群：在分离膈神经前应尽量将大鼠仰卧，且头偏向要分离的膈神经的对侧，这样可在寻找、分离时充分地暴露膈神经；用弯头小镊从颈外静脉和胸锁乳突肌之间的血管肌肉间隙向深层作钝性分离，直至脊柱旁；②辨认膈神经：大鼠膈神经主要由第Ⅳ、Ⅴ对颈神经的腹支汇合，从斜方肌的腹缘进入胸腔，沿心包和中膈下行支配膈肌。在颈部脊柱旁，可看见粗大、并且斜向前肢走行的白色臂丛神经，用棉签细心分开脊柱表面的结缔组织，可观察到从臂丛神经发出的头发丝粗细的膈神经紧贴着斜方肌垂直下行（注意这里只有膈神经是垂直往下走行的）。③剥离膈神经：正确辨认膈神经后，用光滑、头端钝圆且弯曲的细玻璃分针，蘸少许生理盐水，从膈神经的外周端轻轻将神经周围的结缔组织剥离掉（不要在神经上来回擦动免伤神经），游离出约1cm的膈神经，在其下穿黑线标记备用。用蘸有温热生理盐水的棉球湿润神经。④颈外静脉插管：在分离膈神经的对侧颈部切口处，从外上到内下小心分离皮下组织，显露并分离颈外静脉，结扎远心端，并用血管夹夹住近心端，于颈外静脉管壁剪一"V"形切口，切入深度为静脉的1/3？郯1/2，沿此切口将备好的充满生理盐水的PE导管插入约1.5？郯2.0 cm，用线结扎固定2道。导管的另端连接三通管，用注射器回抽有血，注入生理盐水无阻力、无渗漏则表明导管位置合适，且没有扭转。后续实验中大鼠需追加麻药时可直接通过三通管进行，若大鼠需较长时间实验，三通管也可连接微量注射泵，缓慢而匀速地补充生理盐水，能维持大鼠以较好的状态。⑤缝合颈部切口：膈神经分离后将标记好的线盘曲一团（较显眼），以贴近神经处放置。手术缝合应按解剖层次分层进行，不要卷入或缝入其他组织。缝合的创缘距与针间距要均匀一致，这样受力及分担的张力一致并且缝合严密，皮肤缝合松紧度合适，既可防止后续实验中因缝合不严而致滴加的石蜡液在皮兜中渗漏，也可预防因缝合过紧影响到大鼠呼吸及膈神经放电。⑥背侧找到膈神经：缝合后将大鼠翻转，在颈背后进行手术，沿膈神经分离侧斜方肌向深部钝性分离，贴肌缝下行，找到标记的黑线团，小心挑起膈神经，滴加预温37℃的石蜡液保护膈神经。

2.4记录膈神经放电 ①钩挂膈神经：把大鼠连同鼠板移入铜网屏蔽室，使用立体定位仪将大鼠固定在实验台上（以便观察中枢微量注射药物对膈神经放电的影响），利用鼠板上的立柱，穿线钩挂，做好皮兜，充分暴露膈神经，滴加石蜡液浸泡神经。将钩状铂铱合金双极电极固定于三维调节器上，移动调节器，使电极接近膈神经，勾住膈神经后再轻轻抬起电极。②放电记录：打开Biopac 16导电生理记录系统（美国），设置好电极对应的通道（通道A1至A16分别对应1-16个通道，采集信号可以通过硬件上的通道选项选择；从MP150菜单中选择Setup Channels，通过出现的Input Channels对话框设置采集信号的通道。），指定采集设置（包括：数据存储、采集速率、采集持续时间等参数），点击START按钮，可见膈神经呈簇状放电（见图1）。使用结束后要及时保存数据，关闭电源。

3注意事项及实验体会

3.1 麻醉 啮齿类动物对急性缺氧的耐受性较低，对所致呼吸抑制作用比较敏感，麻醉过深易造成实验动物发生呼吸抑制，如不能尽快完成气管插管极易致实验动物死亡；麻醉过浅则可能在插管及后面的膈神经分离过程中造成强烈应激，严重影响动物的生理状态。因此麻醉时，力争一次麻倒大鼠，这就需要在老师的指导下认真操作，大鼠要抓牢，进针位置要靠大鼠下腹部，注射器针体要倾斜30°左右，进针1cm后回抽无血、无阻塞再注射药液，确保药物进入腹腔。实验过程中，当麻醉程度降低时要及时追加麻药（颈外静脉插管补充麻药），保持偏深的麻醉状态。往往在做完手术正式引导膈神经放电时，动物开始清醒，出现挣扎，这时也最容易损伤膈神经，所以应追加麻药，以免影响实验结果。

3.2气管插管 颈部切口要正中，颈部肌肉和筋膜时要钝性分离，尽可能找到肌缝，分开即可见到气管，一定要避免损伤血管，引起大出血和过多组织液渗出；实验前要多准备些粗细不等的气管插管，根据实验鼠的体重范围选择相应直径的插管，插管要尽量轻柔、快速，因为插管本身对气管壁就是个很强烈的刺激，易使气道分泌物增多，插管内或气道内黏液阻塞，引起大鼠窒息。插管过程中要紧密关注大鼠状况，若气道分泌物增多，应及时用细纸条或注射器针头清理。

3.3分离膈神经 找准并成功分离膈神经是记录膈神经放电实验的关键步骤。寻找膈神经时紧贴颈总动脉分离，找到白色成束状向前肢方向移行的臂丛，斜搭在臂丛根部的与气管平行、状如头发丝且透明有弹性的神经即为膈神经。分离时应把神经周围的结缔组织分离干净，分离过程要小心仔细，注意保护神经，不能用金属划神经，以免损伤，滴加生理盐水，防干。勾挂膈神经时把事先放置在膈神经下方的手术线轻轻提起，拉动膈神经轻轻搭在电极上，使电极悬空，不要触及周围的肌肉等组织。

3.4神经放电记录过程中的干扰排除 干扰的来源是多方面的，首先要确定其来源是物理性的还是生物性的[3]，其次是利用引导电位的路径采用摒除、隔离分析等方法寻找干扰来源，要有针对性地逐一排除。①静电及电磁干扰的排除：静电及电磁为常见干扰，采用屏蔽室、屏蔽网进行屏蔽，对电源线路尽可能屏蔽，且所有屏蔽材料均需接地。将地线与引导线远离带电流的导线，记录仪器的输入部分远离静电场或电磁场，且仪器本身也要通过外壳接地。注意交流电50Hz的影响，屏蔽室内不要设置带电源的未进行屏蔽的物体，如台灯、日光灯、实验台的保温装置等，确因需要，也尽量在记录时关闭。②生物性干扰的排除：实验动物可通过切口附近引导接地。尽量使实验动物处于深度麻醉，此时，动物呼吸平稳、肌肉松弛，要使实验动物处于良好的状态，记录时间长时要保温、补液，神经要浸泡在预温的石蜡油中，防止实验标本逐渐干燥。膈神经上不能有血块、毛发等杂质附着。

3.5 神经放电信号的辨认 很多同学在一开始容易把干扰信号误当作膈神经放电，膈神经放电的基本特征是：在背景放电（噪声）的基础上，成束的节律性放电，而且可观察到电脑屏幕上的放电波形与动物的吸气运动以及监听器中发出的放电声音三者同步。

参考文献：

[1]赵春玲，冯志强，陈燕，等.大鼠膈神经和迷走神经放电以及呼吸和心电图同步记录技术[J].泸州医学院学报，2007，30（2）：90-91.

[2]卢记明，张炳熙.大鼠气管插管方法学概述[J].中国比较医学杂志，2009，19（8）：76.

[3]李小英，罗荣敬，周乐全，等.电生理实验中的常见干扰及其排除方法[J].中华临床医学研究杂志，2005，11（14）：2096.编辑/王海静