郁李花粉生活力及贮藏特性的研究

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摘 要：以郁李花粉为试材，利用离体培养法、碘-碘化钾染色法、醋酸洋红染色法和TTC（氯化三苯基四氮唑）染色法对花粉生活力进行测定，并研究了不同贮藏条件对花粉萌发的影响。结果表明，培养基中添加不同浓度的蔗糖和硼酸对花粉的萌发有促进作用，郁李花粉萌发的最适培养基为：15%蔗糖+0.004%硼酸，萌发率达41.52%。花粉生活力随贮藏时间的延长而下降，不同的贮藏条件对其有显著的影响，适当的低温可有效延长花粉贮藏时间。其中-80 ℃萌发率最高，为最佳贮藏方法。

关键词：郁李；花粉；生活力；贮藏

中图分类号：S662.3 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.05.002

郁李（Prunus japonica Thunb）为蔷薇科梅属灌木，桃红色宝石般的花蕾，繁密如云的花朵，深红色的果实，美丽可爱，是园林中重要的观花、观果树种 [1]。

花粉在有性繁殖中传递着雄性亲本的遗传信息。在农业和林业的常规育种中，为了进行人工辅助授粉或杂交授粉，需要早期采集和贮存花粉。尤其是在杂交育种工作中，研究花粉的生活力和育性是必不可少的基础性工作[2]。保存花粉的活力是解决亲本花期不一致或远距离杂交的主要途径。花粉生活力的鉴定是采集和贮存花粉必须的检测内容。不同类群植物花粉在自然条件下的寿命、花粉的适宜贮存、营养条件以及花粉生活力的适宜测定方法均有所差异[2]。掌握适宜的培养、贮存方法及生活力检测的方法对于提高植物育种效率具有较高的实际应用价值。

国内外对郁李的研究主要集中在栽培[1]、园林应用[3]、病虫害防治[1]等方面，对郁李花粉生活力及其贮藏特性研究尚未见报道。为此，笔者通过用染色法、培养基萌发法对郁李花粉生活力进行了探讨，并研究了不同贮藏条件及时间对其花粉生活力的影响，以期为郁李的引种、育种提供依据。

1 材料和方法

1.1 材 料

郁李花粉采于河南科技学院院内。于晴天上午10：00采集，选取含苞待放的花朵，带回实验室后去除花瓣取花药于培养皿内，置于（25±1） ℃的培养箱散粉12 h后，收集花粉备用。

1.2 最佳培养基筛选

采用2因素（蔗糖、硼酸）完全随机试验，蔗糖为0，10%，15%，20%，25%；硼酸浓度为0，0.001%，

0.002%，0.003%，0.004%，0.005%。培养基均添加琼脂8 g·L-1，pH值调至5.8。

将培养基倒入凹玻片的凹处，与盖玻片表面平行，待冷却后，用头发丝蘸取花粉均匀散于培养基上，将凹玻片置于铺有两层湿滤纸的培养皿中，在（25±1） ℃的培养箱中培养2，4，8，16 h后，观察统计出萌发的花粉数和未萌发的花粉粒数。计算萌发率，每处理3次重复，每重复统计花粉数不少于100粒。

萌发率=萌发花粉粒数/总花粉粒数×100%

1.3 花粉染色法

1.3.1 I2-KI染色法 用头发丝蘸取花粉置于载玻片上，加一滴I2-KI溶液，盖上盖玻片，静置3～4 min后置于显微镜下观察。染色后有生活力的花粉呈蓝色，无生活力的花粉无色。观察3张载玻片，每个载玻片取3个视野进行观察，计算有生活力的花粉所占百分率的平均值。

1.3.2 TTC（氯化三苯基四氮唑）染色法 用上述方法蘸取花粉置于载玻片上，加1滴0.5%TTC溶液，盖上盖玻片，置于30 ℃恒温箱中，10～15 min后镜检。凡被染红色的花粉活力强，淡红色次之，无色者为没有活力或不育花粉。观察3张载玻片，每张载玻片取3个视野进行观察，计算有生活力花粉所占百分率的平均值。

1.3.3 醋酸洋红染色法 蘸取花粉置于载玻片上，加一滴醋酸洋红溶液，盖上盖玻片，立刻置于显微镜下观察。凡被染成红色的均为有生活力的花粉。

1.4 贮藏方法

花粉采集阴干后，装入离心管放在以下4种环境条件下贮存：A.室温；B. 4 ℃；C. -20 ℃；D.-80 ℃。贮藏5，10，15，20，25 d后，取出花粉置于1.2所得最佳培养基培养，16 h后观察统计花粉萌发率。花粉耐贮藏力是以待测花粉活力保持时间即待测样活力降为零的时间长度来表示[4]。

2 结果与分析

2.1 离体培养法对郁李花粉萌发的影响

表1表明，花粉在单一蔗糖或硼酸的培养基上萌发率很低，其中20%蔗糖单独使用时最好，花粉的萌发率为21.17%，硼酸单独使用时以0.004%最好，萌发率为15.59%，但试验统计发现，20%蔗糖+0.004%硼酸培养基并不是花粉萌发的最适培养基。在完全随机试验中，蔗糖、硼酸、蔗糖×硼酸差异都极显著。表1表明，蔗糖和硼酸最佳的培养基为：15%蔗糖+0.004%硼酸，花粉萌发率最高，发芽率达41.52%。

2.2 TTC染色法、I2-KI染色法和醋酸洋红染色法

观察发现，用碘-碘化钾染色后，染成深蓝色（即有生活力）的花粉有24.6%，黄褐色（即缺失生活力）的花粉为75.4%；而TTC染色后，所观察的视野中郁李的花粉粒均未染色；醋酸洋红染色后，呈深红色（即有生活力）的花粉粒达89.2%，浅红（无生活力）的花粉粒为11.8%。以上3种染色方法均与离体培养法最佳培养基得出的萌发率（41.52%）相比，差距很大。因此，醋酸洋红染色法、碘-碘化钾法、TTC法均不易作为测定郁李花粉生活力的染色剂。

2.3 不同贮藏环境条件对花粉生活力的影响

由表2可知，不同贮藏条件对花粉生活力有明显的影响，花粉萌发率随着贮藏时间的延长而下降。花粉在常温下保存生活力明显下降，所以花粉不适宜在常温条件下保存（图1-1）。在低温（4 ℃和-20 ℃）条件下，花粉生活力呈较小幅度平稳下降，但整体上萌发率不高，到第25天花粉生活力仅为3.73%和6.35%（图1-2，图1-3）。在超低温（-80 ℃）条件下，花粉生活力的变化趋势非常缓和，花粉的萌发率明显高于其他环境条件，贮藏25 d后萌发率还可达到17.49%（图1-4）。综合比较，郁李花粉贮藏的最佳方式为超低温（-80 ℃）贮藏，可较长时间保持花粉生活力，室温环境不利于花粉的长期贮藏。

3 结论与讨论

3.1 花粉生活力鉴定的方法

目前，关于花粉生活力鉴定的方法很多，主要有显微镜形态观测、染色法、培养基发芽法[5]，其中染色法又有TTC染色法、醋酸洋红染色法、I2-KI染色法等。利用染色法进行花粉生活力测定具有快速简便的优点，但受花粉自身特性（如花粉壁的厚薄，花粉外壁的组成物质，花粉内各种酶活性的强弱等）的影响较大，因此，不同的染色法只适合某些植物花粉生活力的测定。赵统利等[6]对百合花粉生活力测定也认为，I2—KI法不能准确表示花粉的活力。本试验测得的数据也证明了这一点。而培养基发芽法应用较为普遍，并且其测定结果比较精确可靠[7-9]，但不同植物花粉萌发的时间不同，适合萌发的条件也不同[7-10]。笔者采用培养基发芽法来测定郁李花粉的生活力。

3.2 最佳培养基筛选

有关研究认为，在培养基里添加适宜浓度的蔗糖和硼酸有利于花粉的萌发，蔗糖一方面为花粉萌发和花粉管的生长提供营养，另外还起着维持花粉与培养液之间渗透平衡、避免花粉及花粉管破裂的作用[11]。硼酸可以促进糖的吸收和代谢，与糖结合能极大地提高花粉的萌发率，增加氧气的含量和吸收，参与果胶物质的合成[12]，利于花粉管的建造[13]。本试验分别采用不同浓度的蔗糖和不同浓度的硼酸进行试验，得出最适合郁李花粉萌发的蔗糖浓度为20%，硼酸浓度为0.004%，萌发率分别为21.17%和15.59%。但通过完全随机试验后，确定出最适合郁李花粉萌发的培养基组合为15%蔗糖+0.004%硼酸，萌发率达41.52%。

3.3 最适贮藏方法筛选

花粉在不同的温度下表现不同的耐贮藏力[14]。总的来说，低温条件下花粉活力保持时间较室温条件下花粉活力保持时间要长，本试验也证明了这一点。花粉在干燥、低温、真空中贮藏可以有效延长花粉活力的保持时间[15]，研究还证实超低温条件下贮藏花粉，有效延长花粉活力保持时间[16]。对于大多数植物的花粉来说，温度、湿度、大气成分[17]是贮藏条件的3个重要因素，其中温度的影响尤为重要[17]。原因是低温降低了花粉的呼吸强度，花粉的代谢速度减小从而延长花粉活力保持时间。低温对于延长花粉活力的保持时间是有效的。本试验结果也表明，郁李花粉贮藏的最佳方式为超低温（-80 ℃）贮藏，贮藏25 d后萌发率达到17.49%，室温环境不利于花粉的长期贮藏。

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