五味子特殊类型白果五味子的ITS2序列鉴定研究
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[摘要] 目的：以ITS2片段作为DNA条形码，在分子水平上研究白果五味子。方法：结合五味子和华中五味子样品对白果五味子进行研究，对样品ITS2片段进行双向测序，CodonCode Aligner拼接序列，利用MEGA 5.0进行多序列比对，利用ITS2数据库及其网站预测ITS2二级结构，应用BLAST 1方法进行鉴定分析。结果：白果五味子样品ITS2序列长度为231 bp，BLAST 1鉴定白果五味子样品为五味子。白果五味子和五味子居群间平均K2P （Kimura-2- parameter）遗传距离（0.002 2）远远小于五味子和华中五味子的种间平均K2P遗传距离（0.021 6）。结论：ITS2鉴定白果五味子属于五味子；ITS2可以用于鉴定和区分五味子和华中五味子。
[关键词] 五味子；ITS2；居群；DNA条形码
[收稿日期] 2013-11-15
[基金项目] 国家科技基础性工作专项重点项目（2007FY1106002010）；辽宁省教育厅项目（LT2010067）
[通信作者] 王冰，教授，博士生导师，主要从事药用植物种质资源与质量研究，Tel：15998530566，E-mail：
[作者简介] 李先宽，博士研究生，主要从事药用植物种质资源与质量研究，Tel：13591727569，E-mail：
五味子为木兰科多年生落叶木质藤本植物五味子Schisandra chinensis （Turcz.）Baill的干燥成熟果实[1]，是历代药典收载的常用药材。作为一种传统中药，常用于治疗干咳，哮喘，盗汗，遗精和慢性腹泻等[2-3]。五味子是辽宁省最重要的道地药材，由于近些年五味子的广泛种植，其广泛的种源，即种质资源来源不一致是影响五味子质量的一个重要因素[4]。从2008年开始，本课题组一直追踪观察辽宁省栽培五味子所结果实为白果的一种特殊类型――白果五味子[5]，其药材质量的优劣是一个需要认真研究的问题。its2片段具有适合扩增和测序的长度，在物种水平的变异较快，有更多的突变位点以区分不同的物种，因此，在DNA条形码鉴定物种方面具有潜在的研究价值。本研究利用核基因ITS2片段作为DNA条形码[6-10]，结合五味子和华中五味子，在分子水平上对白果五味子基原植物进行研究，探索白果五味子和五味子的亲缘关系，提供白果五味子DNA分子水平的鉴定资料，为明确辽宁省道地药材五味子种质资源的遗传多样性以及合理保护和利用五味子种质资源提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料 供试样品（植物叶片）于2012年6―9月采集，包括3个栽培居群和3个野生居群，共计53份样品，包括五味子和华中五味子2个物种。样品经硅胶迅速干燥后，置于-86 ℃超低温冰箱保存备用。白果五味子有针对性的取8个样株，在同一农场内随机取正常的五味子5个样株，其他样品均为随机取样，样品信息见表1。样品经辽宁中医药大学药学院王冰教授鉴定为五味子S. chinensis和华中五味子S. sphenanthera Rehd.et Wils.，凭证标本保存于辽宁中医药大学药用植物实验室。
1.2 仪器和试剂 台式冷冻离心机（Fresco）、数显恒温水浴锅（HH-S型，巩义市予华仪器有限责任公司）、PCR仪（MG96G型，杭州朗基科学仪器有限公司）、电泳仪（EPS-600型， 上海天能科技有限公司）、凝胶图像处理系统（Tanon-4100，上海天能科技有限公司）、植物基因组DNA提取试剂盒（离心柱型，TIANGEN）Taq MasterMix（康为世纪）、引物（上海Sangon公司）、5kDNA Marker （北京全式金生物技术有限公司）、琼脂糖、EB （上海Sangon公司）， ABI 3730XL 测序仪，其余试剂均为分析纯。
1.3 DNA的提取 选取硅胶干燥的植物叶片约20 mg， 用液氮研磨粉碎， 使用试剂盒提取总DNA，具体步骤参照植物基因组DNA提取试剂盒（离心柱型，TIANGEN）的操作。
1.4 PCR扩增及产物测序 扩增ITS2序列正向引物5′-GCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向引物5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。PCR反应体积50 μL，引物各1.0 μL（2.5 μmol・L-1） （Sangon Co.， 中国），25 μL Taq MasterMix，总DNA 1 μL（约20 ng），加RNase-Free 水补足50 μL。引物及扩增程序参照Chen等[6]的研究方法。PCR扩增产物经纯化后， 使用ABI 3730XL测序仪（Applied Biosystems Co.， USA） 进行双向测序。
1.5 数据处理 测序后所得序列采用 Codon Code Aligner V 3.0.1（CodonCode Co.， USA）校对拼接， 去除低质量序列及引物区， 采用基于隐马尔可夫模型HMMer注释方法将实验数据与从GenBank下载的ITS2序列的两端5.8S和26S去除以获得ITS2间隔区序列[11]。利用MEGA 5.0进行多序列比对。根据Schultz等[12]建立的ITS2数据库及其网站预测ITS2二级结构。
2 结果与分析
2.1 样品DNA提取、PCR扩增效率、序列信息和测序成功率 硅胶干燥叶片进行DNA提取，对提取后的DNA进行电泳检测，结果显示所有样品电泳条带较亮、清晰。PCR扩增效率和测序成功率是评价DNA条形码序列的一个重要指标， 由琼脂糖凝胶电泳得到 PCR 扩增电泳图，可知ITS2序列的PCR扩增效率为100%；五味子和华中五味子供试样品测序成功率也均为100%。表明ITS2序列对于五味子和华中五味子有非常高的PCR扩增效率和测序成功率。测序所得序列经校对拼接， 去除低质量序列及引物区，并依照Keller等的方法[11]注释处理后，所有样品序列长度为231 bp，白果五味子样品序列为CGCTTTGCGACGCTCCCCTCCCTCCCATTCTCCTTTT TGGGTGTATGGTGTTTGCGAGGAGCGGATATTGGCTGC CCGTGCCATGTTTGTGCGGTCGGCCGAAAGATGGGCCC CTGGTGTGTTGTGACACGACGAGTGGTGGTCA AATGCCCTTCTCACCGCGTGGGACGTCGAGTCGCATTCCTTGT GGCTCTTGGGACTCTTGGAGCCGCTTCGCG GCAACCTGCATCG。
2.2 供试样品基原植物居群内、居群间、种内变异分析 白果五味子（BG） 8个样品，ITS2序列之间没有变异位点产生，与白果五味子处于同一农场内的五味子（HG），栽培品种红珍珠（HZZ）和千山野生居群（QS）样品在86 bp处产生了各自居群内部碱基不同的现象。各居群在86 bp处碱基为A的概率分别为BG 0，HG 40%，HZZ 10%，QS 80%；各居群在86 bp处碱基为C的的概率分别为BG 100%，HG 60%，HZZ 80%，QS 20%。HZZ-2在8，44，72，176，183，229 bp存在6处变异位点。华中五味子2个居群，共20个样品，2个居群在178 bp处碱基为A的概率分别为LB 60%，PL 40%。PL居群内样品1和7在58，227 bp存在2处变异位点，2个位点碱基均为T，见表2。
白果五味子和五味子基原植物ITS2序列居群间平均K2P距离为0.002 2，白果五味子种内平均K2P距离为0.000 0，五味子种内平均K2P距离为0.004 0；华中五味子居群间K2P距离为0.002 6，华中五味子种内平均K2P距离为0.002 5，见表3。
2.3 供试样品基原植物种间变异分析 白果五味子和五味子居群内供试样品，在位点10， 37， 42，235 bp处和华中五味子样品不同，故五味子和华中五味子样品可以根据这些碱基位点的不同进行区分和鉴别，见表4。因此，ITS2片段可以用于区分五味子和华中五味子。五味子和华中五味子基原植物ITS2序列种间平均K2P距离为0.021 6，种间最小K2P距离为0.017 5，见表3。
2.4 ITS2作为DNA条形码候选序列对样品鉴定效率评价 采用Ross等[13]报道的比对法（BLAST 1）对各序列进行鉴定。结果表明BG，HG，HZZ，QS居群所有供试样品均为五味子，对五味子样品的鉴定效率为100%，参考序列AB558158.1；LB和PL居群，华中五味子样品能100%鉴定到属，参考序列AF263437.1。
2.5 白果五味子及位点86 bp处碱基为“A”的五味子样品ITS2序列二级结构 根据Koetschan等[14]建立的ITS2数据库及其网站预测白果五味子及位点86 bp处碱基为“A”的五味子样品（如千山1号样品）ITS2序列二级结构上有明显差异，重点差异存在于HelixⅡ中，白果五味子比千山1号样品HelixⅡ上多了1个茎环；白果五味子与红珍珠2号样品的ITS2序列二级结构明显差异主要存在与HelixⅠ和HelixⅢ上，红珍珠2号样品HelixⅠ上的最后1个茎环要明显大于白果五味子HelixⅠ上的最后1个茎环，同时HZZ-2样品HelixⅢ上比白果五味子和QS-1类样品多1个茎环，且红珍珠2号样品中心环与白果五味子、QS-1样品的中心环有较明显区别，见图1。
3 讨论
五味子ITS2序列较短， 在所测样品中均为231 bp， 降低了提取、扩增和测序的难度， Kress 等[15]认为短序列更有利于获取发生降解的样本序列， 这对于DNA 条形码在五味子实际鉴定中的应用具有重要的意义。ITS2作为DNA条形码候选序列，可以用于鉴定和区分五味子和华中五味子；ITS2序列对所结果实为白果的五味子样品能鉴定为五味子，而不能用于鉴别和区分白果五味子和五味子。另外，ITS2并不能解决所有的物种鉴定问题。例如Caragana tibetica和C. ordosica有相同的ITS2序列，但相关研究表明2个物种有不同的ITS序列。因此，可以结合植物DNA条形码其他候选序列psbA-trnH，rpoB，rpoC1，rbcL，matK，以及在系统进化中应用广泛的核ITS序列对白果五味子进行更深一步的研究。
对五味子供试样品来说，千山野生居群在86 bp处碱基为A的的概率为80%，而3个栽培居群共计23个样品，在86 bp处碱基为A的的概率平均为16.67%。本实验结果表明，五味子栽培品种在选育过程中，ITS2序列可能在86 bp处产生了位点变异，以满足适应不同的生长环境和符合五味子栽培品种选育的目的等要求。推论有待通过扩大五味子野生样品和栽培样品的收集范围和更大样本量来证实。五味子栽培品种红珍珠，样品HZZ-2有6处位点与其他红珍珠样品不同（表2）。为此，本课题组再次核实了植物标本，确认为五味子样品；同时用比对法（BLAST 1）对HZZ-2的ITS2序列进行再次鉴定（GenBank登录号AB558158.1），结果仍确认为五味子。
五味子是辽宁省最重要的道地药材，目前野生五味子已面临枯竭，人工种植五味子已成为当地农民发家致富的有效手段。白果五味子在辽宁省凤城市和东港市等五味子基地均有少量分布，据本课题组统计，白果五味子植株与基地五味子植株在1∶3 000左右，多年跟踪观察发现其遗传性状较为稳定。在收获季节，占少量份额的白果五味子并不被认可，这给广大药农带来了很大困惑。目前关于白果五味子的研究较少，对其ITS2序列研究尚未见到有关报道。本研究利用核基因ITS2片段作为DNA条形码，对白果五味子基原植物及其五味子栽培居群和野生居群样品序列差异进行分析比较，在分子水平上对其进行研究，对揭示五味子种质资源亲缘关系、遗传背景和指导今后五味子栽培育种工作及资源的合理保护具有重要意义。
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Identification of Schisandra chinensis with white fruits
based on ITS2 sequences
LI Xian-kuan， WANG Bing， ZHENG Yan-chao， LIU Cong， DING Pu， SONG Xin
（Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Dalian 116600， China）
[Abstract] Objective： To analyse a special kind of Schisandra chinensis with the white fruit using ITS2 barcode at molecular levels. Method： ITS2 regions were sequenced bidirectionally. Sequence assembly and consensus sequence generation were performed using the CodonCode Aligner， MEGA 5.0 software was used to align the sequences. The ITS2 secondary structure was predicted using ITS2 web server， BLAST 1 method was used to identify the S. chinensis with the white fruit. Result： The length of the ITS2 sequence was 231 bp. And the sample was identified as S. chinensis using the method of BLAST 1. Their mean interspecific genetic distance （K2P distance） among the populations of the S. chinensis with the white fruit and S. chinensis was far lower than the mean interspecific genetic distance between the S. chinensis and S. sphenanthera. Conclusion： By using ITS2 the S. chinensis with the white fruit was identified as S. Chinensis， and the ITS2 barcode could be used to identify S. chinensis and S. sphenanthera.
[Key words] Schisandra chinensis； ITS2； population； DNA barcode
doi：10.4268/cjcmm20141112