盐溶蛋白电泳法鉴定玉米种子纯度常见问题及处理方法

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摘要 介绍了盐溶蛋白电泳法鉴定玉米种子纯度常见问题及处理方法，以期为玉米种子纯度鉴定提供参考。

关键词　盐溶蛋白电泳法；玉米种子；纯度鉴定；常见问题；处理方法

中图分类号 S339.31；S513 文献标识码 B 文章编号 1007-5739（2012）17-0069-01

盐溶蛋白电泳法鉴定玉米种子纯度是基于品种间种子贮藏蛋白中盐溶蛋白质的组分差异来鉴定玉米种子纯度[1]。从玉米种子中提取出的盐溶蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩效应、分子筛效应、电荷效应作用下得到分离，通过染色显示系列蛋白质谱带根据谱带差异情况鉴定玉米种子的真实性和品种纯度。该方法快速准确、经济实用，于2001年被列为行业标准。该标准是我国第一部利用种子贮藏蛋白电泳技术鉴定玉米种子纯度的行业标准。标准的实施为我国玉米种子室内纯度鉴定提供了重要的手段，在玉米种子纯度检验工作中得到了广泛的应用。笔者结合工作实践总结在实际使用该标准中可能遇见的问题及处理建议，以供同行们商榷。

1 凝胶液不凝或者聚合缓慢不能形成胶体

如果在胶液中加入催化剂过氧化氢后，凝胶液不凝或聚合缓慢不能形成胶体，可能由以下几个原因造成：一是药品纯度不够；二是试剂配比不当；三是胶液过期；四是催化剂失效。在实际操作中，常常会碰到分离胶能够聚合，而浓缩胶不能聚合成胶体的情况，这是因为浓缩胶对试剂纯度的要求比分离胶液更高，若出现该种情况，首先，要特别注意N，N-亚甲基甲叉双丙烯酰胺的纯度和保质期，要求其纯度最好是99.0%以上的分析纯；其次，由于抗坏血酸不稳定，极易分解，因此在胶液中可适当增大抗坏血酸的比例至标准中的1.5倍或2.0倍。可促进胶液聚合，并可有效延长胶液的保存期30～40 d。

2 点样孔破裂较多

从浓缩胶中拔出样品梳时，点样孔破裂较多，会使试验终止。这是应用电泳法检测种子纯度最常发生的情况，可能有以下几种原因，一是样品梳齿厚度不合适；二是催化剂过氧化氢的用量不合适；三是凝胶聚合的时间不够；四是拔梳子时用力不均，方式不对。通常在进行该步操作时，首先，要仔细检查样品梳齿的厚度与两玻璃板狭槽是否合适，不能过紧，要稍微有一点空隙为宜，否则凝胶聚合后，很难拔出。其次，催化剂的用量要合适，量少聚合时间长，量多聚合太快，最好先进行预试验，确定催化剂的用量及聚合时间再倒胶，按经验，通常5 mL的浓缩胶液加入5～6 μL的3%过氧化氢，聚合4～5 min，再拔出梳子较适宜。再次，拔梳子时，把短玻璃面朝向自己，双手平放在梳子的近两端处，两手均匀用力，先前后稍微平晃一下梳子，再把手放在梳子中部，前后稍微平晃一下梳子，造成梳子整体松动，然后两手先放在梳子近两端处向左右稍拉紧梳子同时再缓慢向上抬起梳子，注意如果两端梳子齿已抬起而中部梳子齿未抬起时，不能再向上抬，可把两手平放在近中部，稍倾斜往自己怀里方向缓抬，使中部梳子齿抬起，最后再把手放在梳子近两端处缓慢向上抬起，同时稍往自己怀里方向晃动，一次性拔出梳子，即可获得较满意的点样孔。

3 凝胶粘板

电泳后，从2块玻璃板中取出凝胶时，常会出现凝胶粘板不好剥离的情况。产生的原因通常：一是玻璃板清洗的不干净或有划痕。因此，在清洗玻璃板时，一定要仔细，先用软毛刷小心刷洗玻璃板两面，并在蒸馏水中浸泡然后放在玻璃架上自然晾干或烘干。二是取凝胶时温度较高。一般电泳完成后，玻璃板还很热，如果马上卸板取出凝胶就容易出现凝胶粘板不好剥离的情况。通常从胶条上取出玻璃板后稍放置一段时间，让凝胶冷却或用冷水冲玻璃板两面散发凝胶热量再卸板。也可把取下的玻璃板直接放在冷水中，通过热胀冷缩效应使玻璃板与凝胶分离再进行卸胶。

4 蛋白质谱带问题

4.1 蛋白质谱带较少或样品间普带宽窄及着色深浅不一

凝胶染色后，有的样品蛋白质谱带较少或样品间谱带宽窄及着色深浅差别较大，产生原因可能是样品制作上不规范造成[2]。一是注意样品的磨碎程度要均匀一致，颗粒不宜过粗或过细。二是粉碎的样品装入离心管时，种子胚不能丢失，因为种子胚内有大部分盐溶蛋白，胚丢失会造成蛋白谱带严重缺少。三是离心管内所装的种子颗粒以半管为宜，不宜过多，否则提取液过少，造成某些蛋白未能提取出，致使某些蛋白谱带丢失。四是样品加入提取液后在室温放置时要充分摇匀，同时注意提前时间不宜过长，以防部分蛋白质降解，造成蛋白谱带缺失，一般放置30～40 min即可进行点样。

4.2 谱带弯曲

如果染色后，有些部位蛋白谱带弯曲，可能是分离胶中加入过氧化氢时，过氧化氢分布不均匀，使得凝胶聚合不均，造成蛋白谱带弯曲[3]。在倒分离胶时，加入过氧化氢后要充分摇匀保证胶液均匀一致并注意不要有气泡再倒胶。还有可能是电泳时，电极缓冲液温度过高或凝胶液及电极缓冲液pH值不准确，改变了电泳系统的电阻，一般会使分子量小的蛋白谱带弯曲，可以通过接入冷却水的方法降低电极缓冲液的温度，另外在倒胶和加入电极缓冲液时测一下pH值，并用乳酸调整到准确时再进行电泳。

4.3 蛋白谱带模糊不清

凝胶染色后，发现蛋白谱带模糊不清，可能由以下原因产生：一是凝胶液或样品提取液存放时间过长，使得某些不稳定试剂挥发或失效，造成凝胶染色后蛋白谱带模糊不清，可考虑重新配制试剂并缩短使用期[4]。二是染色液使用次数较多，使得各成分比例不当，染色后会导致蛋白谱带模糊不清。染色液用过1次后，三氯乙酸会有挥发以及考马斯亮蓝会结合在凝胶中的蛋白上，因此下次再使用时要适当添加三氯乙酸和染色液。一般每200 mL染色液，下次再使用时可适当添加5～7 mL的染色原液和50 mL的三氯乙酸。三是电泳时电极缓冲液温度过高或pH值不准确，导致电泳速度过快。染色后蛋白谱带变宽，模糊不清，甚至弯曲。电泳前要准确调整电极缓冲液pH值，并通过连接冷却水来降低电极缓冲液的温度。四是样品提取时，放置时间过短或过长。染色后也会造成蛋白谱带模糊不清。样品提取时放置时间过短，蛋白没有提取出或含量较少；放置时间过长，提取的蛋白会部分降解，此2种情况均会导致染色后蛋白谱带模糊不清或谱带缺失。一般提取时间在30～50 min较适宜。染色后蛋白谱带清晰，分辨率高。

5 参考文献

[1] 王玺，张宝石.玉米种子纯度鉴定技术研究进展[J].种子，2002（1）：43-45.

[2] 闫米格，许晶，骈跃斌，等.玉米种子纯度鉴定中DNA提取方法的比较研究[J].山东农业科学，2011（9）：7-8，14.

[3] 刘景云.玉米种子纯度鉴定方法[J].现代农业科技，2011（3）：103-104.

[4] 罗长安，周本义，蔚世林，等.蛋白质凝胶电泳技术在玉米种子纯度鉴定中的应用[J].种子科技，2007，25（2）：41-43.