临床荧光定量PCR检测中问题及原因分析

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随着定量pcr商品试剂盒的推出，目前国内很多医疗机构开展了病原体核酸检测，但PCR反应最大的特点是具有较大扩增能力和极高的灵敏度，稍有不慎即可引起检测结果较大的差异和极微量的污染，即可造成假阳性。

1 检测结果差异大

PCR检验操作主要是标本处理中的核酸提取步骤，其中涉及的主要是移液器的使用，尽管操作简单，但均为微量操作。目前国内所使用的Taqman荧光定量PCR测定技术均为外标定量方法，PCR反应体系小的区别也会对扩增效率造成较大的影响，从而使模板定量测定精密度和重复性不佳，从实际工作来看，不同操作者所测的结果差异较大，强调样本核酸提取的标准化，核酸提取不规范、不准确，后面的扩增和定量测定等于零。可通过操作者有计划的培训，强化实验技能，不同操作者平行性检测比对，室内质量控制，室间质量评价来达到自我教育作用，从而提高整体试验质量。

2 污染

PCR检测的污染主要来自3个方面，第一方面是样本间交叉污染，包括收集容器被污染或标本放置时由于密封不严

作者单位：671000云南省大理州人民医院检验科

溢于容器外，或容器外有标本而造成相互间的交叉污染；样本核酸模板在提取过程中高温加热时崩盖形成气溶胶污染；移液器污染导致标本间的污染。第二方面是PCR试剂的污染，包括PCR试剂配制过程中由于移液器、容器、双蒸水及其他共用溶液被PCR核酸模板污染。第三方面是PCR扩增产物的污染，包括在对扩增产物操作时比较剧烈摇动扩增管，开盖吸样时及用污染移液器的反复吸样都可引起污染。实时荧光定量PCR检测实现了扩增管的闭管检测，最大程度上避免了扩增产物的污染。临床PCR室污染监测可通过设置对照试验来达到目的，包括：①阳性对照：它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要参考标志；②阴性对照：强调PCR实验每次必须做阴性对照且包括：a、标本对照：用鉴定后的正常血清作对照，监测实验室以前扩增产物污染，由实验操作所致的标本间的交叉污染和扩增反应试剂的污染；b、水对照：以水为模拟标本经历整个核酸提取过程，功能同标本对照，但对污染的反映更灵敏；c、试剂对照：仅含PCR试剂不加任何DNA或RNA模板直接进行PCR扩增，以监测扩增试剂是否发生污染，具有较强的污染鉴别性；③重复性试验。