褪黑素对急性脊髓损伤大鼠血清及脊髓内神经生长因子表达的影响

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[摘要] 目的 研究褪黑素（MT）对脊髓损伤大鼠血清及脊髓内神经生长因子（NGF）表达水平的影响。 方法 84只健康成年雄性SD大鼠随机分为模型对照组（n = 36）、模型MT组（n = 36）及假手术组（n = 12）。建立脊髓损伤模型后，模型对照组给予无水乙醇，模型MT组给予MT，均为腹腔注射。对比术后12 h、3、5 d大鼠血清及脊髓组织中NGF的表达及Tarlov评分。 结果 术后12 h模型对照组及模型MT组Tarlov评分显著低于假手术组（P < 0.05），模型MT组Tarlov评分稍高于模型对照组，但差异无统计学意义（P > 0.05）。术后3、5 d模型MT组Tarlov评分均显著高于模型对照组（P < 0.05或P < 0.01）。术后12 h、3、5 d模型对照组和模型MT组血清NGF水平、脊髓组织NGF蛋白及NGF mRNA水平均较假手术组显著上升，模型MT组则显著高于模型对照组（P < 0.05或P < 0.01）。 结论 MT通过调高脊髓损伤大鼠体内NGF的表达起到减轻神经细胞损伤、促进神经细胞再生和神经功能恢复作用。

[关键词] 褪黑素；神经生长因子；脊髓损伤；神经保护；大鼠

[中图分类号] R745.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）04（a）-0009-03

褪黑素（melatonin，MT）是一种由松果体分泌的具有多种生物效应的神经内分泌激素，以往多种研究表明其对脊髓损伤具有清除氧自由基、抗炎、减少神经细胞凋亡等脊神经保护作用[1-3]，而对其促进神经系统修复及对神经生长因子（nerve growth factor，NGF）水平影响的相关研究较少。NGF是首个被发现的内源性神经营养因子，由神经细胞和神经胶质细胞分泌，对神经细胞具有强大的修复、保护作用[4]。本研究通过观察MT对脊髓损伤大鼠血清及脊髓内NGF表达水平的影响，探讨MT对损伤脊髓保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

84只8～10周健康成年雄性SD大鼠，体重（250±30）g，购自广东省医学实验动物中心[许可证号：SCXK（粤）2011-0004]。

1.2 试剂与仪器

MT、苏木精、伊红均购自美国Sigma公司，无水乙醇、10%水合氯醛、大鼠NGF检测酶联免疫吸附法试剂盒、兔抗鼠NGF多克隆抗体、Trizol试剂、DAB试剂均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，PCR试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司。美国ABI PCR 9700型PCR扩增仪，美国STAT FAX2100全自动酶标仪，北京君意JY025型凝胶紫外分析仪，HPIAS-1000彩色病理图像报告分析系统。

1.3 脊髓损伤动物模型建立

依据改良Allen法制作脊髓损伤大鼠模型[5]。腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，T11～13为术区，备皮消毒后做正中纵向切口暴露目标棘突和椎板，咬除椎板暴露脊髓硬膜，范围约0.6 cm×0.3 cm。采用质量为10 g的条形金属重锤于距硬膜2.5 cm处做自由落体运动打击暴露处脊髓形成脊髓急性损伤。以大鼠尾部及下肢出现抽搐、硬膜充血水肿为模型建立成功标准。清洗、消毒后缝合术口。

1.4 分组及实验方法

采用随机数字表法将大鼠分为模型对照组（36只）、模型MT组（36只）及假手术组（12只），模型对照组和模型MT组随机分为A、B、C亚组，各12只。模型对照组和模型MT组依“1.3”法制作模型，判断模型成功后，模型对照组各亚组给予100 mg/kg无水乙醇1次，腹腔内注射；模型MT组各亚组给予100 mg/kg MT注射液腹腔内注射1次。假手术组则仅依“1.3”法暴露硬膜，并不损伤脊髓。三组术后进行神经功能评价，继续人工饲养，均给予抗感染（青霉素20万U/d肌注）治疗，生存期>3 d则给药3 d，人工辅助排尿排便（4次/d）。术后12 h模型对照组及模型MT组的A组再次进行神经功能评价后断头处死取材，模型对照组及模型MT组的B、C组分别于术后3、5 d进行神经功能评价后断头处死取材。

1.5 观察指标检测

1.5.1 血清NGF检测 大鼠断头取血2 mL室温静置30 min，3000 r/min离心15 min取血清储存于-20℃冰箱备用。采用大鼠NGF检测酶联免疫吸附法试剂盒检测血清NGF水平，操作方法按试剂盒说明进行。

1.5.2 脊髓组织NGF免疫组化检测 解剖患处，取以T12为中心的约1 cm脊髓生理盐水冲洗，均分为2段。上段进行常规制片苏木精-伊红染色，厚度5 μm，各组按1∶5比例取5张切片，采用兔抗鼠NGF多克隆抗体按试剂盒说明进行染色标记，DAB显色，于显微镜下观察。HPIAS-1000彩色病理图像报告分析系统对每张片随机5个400倍视野阳性神经细胞进行计数，取平均值。神经细胞细胞质、细胞核均呈棕色或棕褐色为阳性。

1.5.3 脊髓组织NGF mRNA检测 采用PCR扩增法。脊髓标本下段于-80℃冻存，取冻存样品研碎后采用Trizol法提取总RNA并逆转录为cDNA，以GAPDH为内参进行PCR扩增，引物序列见表1。取5 μL产物进行凝胶电泳，分析图像对比NGF与GAPDH灰度值，以其比值作为NGF mRNA相对表达量。

1.5.4 神经功能评价 采用Tarlov评分法对大鼠进行神经功能评价，0～5分为完全瘫痪至正常。脊髓损伤模型完成后Tarlov评分为1～4分方能继续进行实验。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 脊髓损伤大鼠模型及神经功能情况

2.2 脊髓损伤大鼠血清NGF水平

2.3 脊髓损伤大鼠脊髓组织NGF蛋白表达情况

2.4 脊髓损伤大鼠脊髓组织NGF mRNA表达情况

3 讨论

MT在神经系统中分布广泛且具有多种生物效应，已经被证实在减轻对脊髓神经细胞的破坏、减少凋亡等方面对脊髓损伤患者神经系统具有保护作用，作为一种功能复杂的内源性激素，MT对神经细胞的增殖、分化同样具有调控作用[6]。NGF通过刺激凋亡抑制因子bal-2表达升高，抑制凋亡促进因子bax蛋白表达，促使bal-2与bax比值偏移，从而减少神经细胞的凋亡。高表达的NGF对损伤轴突有促进生长和加速再生的作用，并且在中枢及周围神经系统中对神经细胞的发育、分化、生长、再生和功能恢复均有重要调控作用[7-8]。内源性NGF在脊髓损伤后表达会保护性升高，但由于无法维持有效浓度从而达不到促进神经系统修复的作用。

本研究采用大鼠建立脊髓损伤模型，由于NGF基因属即早基因，因而在术后立即给药，术后12 h NGF早期表达并开始对神经细胞转归产生影响，术后内源性NGF呈现上升趋势，到第5天达到峰值，因此，本研究选择了术后12 h、3及5 d作为观察时点。研究发现，MT有促脊髓损伤大鼠体内血清及脊髓组织中NGF水平升高作用。通过对三组大鼠术后12 h神经系统功能评价发现，两个模型组大鼠Tarlov评分均显著低于假手术组，而模型MT组评分稍高于模型对照组，但差异不显著。可能由于脊髓仍处于休克状态，症状缓解表现尚不明显。而此时两模型组血清NGF水平、脊髓组织切片NGF蛋白及NGF mRNA表达水平已较假手术组显著上升，模型MT组上升幅度明显高于模型对照组，此后两模型组大鼠体内NGF表达均有上升趋势，模型MT组血清和脊髓中NGF表达出现大幅度升高，而模型对照组上升趋势则较为平缓。不仅如此，两组神经功能恢复状态也呈现显著差异，术后3、5 d模型MT组Tarlov评分有显著回升，下肢运动功能逐渐恢复，且据观察发现大鼠精神状态较好，饮食恢复较快，而模型对照组则进展不明显。表明脊髓损伤大鼠神经功能严重受损，而内源性NGF生理性出现升高，起到保护神经系统的作用，但效果并不佳，而通过给予MT促进内源性NGF的表达，大鼠体内NGF水平明显升高，并可到达有效浓度，对神经系统再生和功能修复产生作用。NGF直接给药会受到利用率低、半衰期短等限制[9]，而MT具有高度脂溶性和水溶性，可轻易透过血脑屏障和细胞膜进入核内发挥作用[10]，促进内源性NGF表达，自身也具有较强的神经保护作用，治疗脊髓损伤具有明显优势。

综上所述，MT对脊髓损伤后神经系统不仅具有减少损伤的保护作用，还通过促进体内NGF的表达促使神经细胞及轴突的再生，调节神经细胞增殖、分化，改善神经功能，增强对神经系统的保护。

[参考文献]

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[3] 丁华，袁志诚，狄荣科.骨髓间充质干细胞移植联用褪黑素对大鼠脊髓损伤修复的影响[J].郧阳医学院学报，2010，29（1）：5-8，封3.

[4] 李棋，麻伟青，王慧明.抗神经生长因子抗体对大鼠慢性坐骨神经压迫损伤模型的脊髓胶质细胞激活的抑制作用[J].昆明医学院学报，2012，33（5）：18-22.

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[8] 陈良.骨髓基质干细胞移植对大鼠脊髓损伤区NGF与BDNF表达的影响[J].四川医学，2011，32（3）：320-323.

[9] 张洁元，段朝霞.嗅鞘细胞移植后大鼠损伤脊髓神经生长因子的表达[J].中华神经外科杂志，2012，28（5）：518-521.

[10] Crupi R，Mazzon E，Marino A. Melatonin treatment mimics the antidepressant action in chronic corticosterone-treated mice [J]. Journal of Pineal Research，2010，49（2）：123-129.

（收稿日期：2012-12-07 本文编辑：程 铭）