三种寡核苷酸纯化方法的比较

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摘要：分别采用固相萃取法、电泳法、色谱法纯化寡核苷酸，色谱分析结果表明产物纯度高，固相萃取法纯化后的产物纯度低于电泳法与色谱法，但产量相对较大，ＰＣＲ检测结果证明３种方法纯化的寡核苷酸具有良好的检测性能。在建立的固相萃取纯化试验条件下，对３种填料纯化寡核苷酸的效果、产量、成本进行了比较分析，结果表明，使用硅胶Ｃ１８和聚苯乙烯－二乙烯基苯填料（ＰＳ／ＤＶＢ）填充的萃取小柱既能达到良好的纯化效果又可降低成本。

关键词：寡核苷酸；纯化；固相萃取；电泳；色谱

中图分类号：ＴＱ４６４．６ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）14－3065-05

Comparison of Three Purification Methods for Oligonucleotides

ＬＩ Ｈｏｎｇ－ｘｉａ

(Textile and Chemical Engineering College, Binzhou Polytechnic, Binzhou 256603, Shandong, China)

Ａｂsｔｒａｃｔ： Ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ， ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｃｒｕｄｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗａｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｐｕｒｉｔｙ． Ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｔ ｆｒｏｍ ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ａ ｌｉｔｔｌｅ ｂｉｔ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ； ｂｕｔ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｗａｓ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｈｉｇｈｅｒ． Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ＰＣＲ ｔｅｓｔ， ａｌｌ ｔｈｅ ３ ｍｅｔｈｏｄｓ ｈａｓ ｇｏｏｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ， ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｃｏｓｔ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｆｉｌｌｅｒｓ ｗａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｇｏｏｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ with ｌｏｗ ｃｏｓｔ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｈｅｎ ｕｓｉｎｇ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ Ｃ１８ ａｎｄ ＰＳ／ＤＶＢ ｆｉｌｌｉｎｇ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ； ｐｕｒｉｆｙ； ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ； ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ； ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ

寡核苷酸是由核苷酸通过３′，５′－磷酸二酯键连接而成的短链ＤＮＡ分子。它可作为ＰＣＲ检测所需要的引物或探针的主要组成部分，广泛应用于生物学、农牧业、医学等领域［１－３］。目前，中国已可使用ＤＮＡ合成仪快速合成各种序列的寡核苷酸以及荧光标记的寡核苷酸，最常用的寡核苷酸为１０～３０ ｎｔ。以链长为２５ ｎｔ的寡核苷酸为例，产物纯度约为８０％～８５％，其中含有一定量的杂质，如５′羟基不完全脱二甲氧基三苯甲烷（ＤＭＴ）保护基团或不完全封闭羟基产生的非目标序列等。这些杂质不但造成寡核苷酸定量不准，还可能影响到下一步的生物学试验。因此，合成后的寡核苷酸需要纯化。目前大多采用的寡核苷酸纯化方法有３种，分别为固相萃取法［４］、电泳法和色谱法。

研究采用美国应用生物系统公司的ＤＮＡ合成仪合成寡核苷酸，分别采用３种方法在优化的试验条件下进行纯化，比较纯化效果；再应用制备的寡核苷酸作为ＰＣＲ检测用引物，成功地从南瓜果实中检测到了黄瓜绿斑驳花叶病毒［５］；另外，对固相萃取法和色谱法纯化寡核苷酸进行了具体的研究。

１ 材料与方法

１．１ 材料

１．１．１ 原料 聚苯乙烯－二乙烯基苯填料（ＰＳ／ＤＶＢ）（粒度５０ μｍ）、ＹＭＣ*ＧＥＬ ＯＤＳ－Ａ制备色谱球形填料／硅胶Ｃ１８（平均孔径１２ ｎｍ，粒度５０ μｍ）购自北京慧德易科技有限责任公司，Ｏａｓｉｓ ＨＬＢ固相萃取小柱（货号ＷＡＴ０９４２２６）、ＸＴｅｒｒａＴＭ ＭＳ Ｃ１８柱（５０.0 ｍｍ×４．６ ｍｍ，平均孔径１４ ｎｍ，粒度２．５ μｍ）购自美国Ｗａｔｅｒｓ公司，筛板、６ ｍＬ萃取柱购自大连思谱精工有限公司，荧光薄层层析板购自青岛海洋化工厂，寡核苷酸购自中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所。

１．１．２ 试剂 三羟甲基氨基甲烷、丙烯酰胺、双丙烯酰胺、溴酚蓝、二甲苯蓝、过硫酸铵（ＡＰＳ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－四甲基乙二胺（ＴＥＭＥＤ）、冰醋酸、三乙胺、乙腈、尿素、三氟乙酸、浓氨水等，以上均为分析纯。

１．１．３ 主要仪器 高效液相色谱仪（包括６００泵、６００控制器、７１７自动进样器、２９９６光电二极管矩阵检测器）、固相萃取装置购自美国Ｗａｔｅｒｓ公司，ＤＹＹ－１０Ｃ电泳仪、ＷＤ９４０３Ｅ手提式紫外灯购自北京市六一仪器厂，ＤＵ６４０核酸蛋白分析仪购自美国ＢＥＣＫＭＡＮ公司，ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００实时荧光ＰＣＲ仪购自美国ＡＢＩ公司，ＰＴＣ－２００梯度ＰＣＲ仪购自美国ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ公司。

１．２ 方法

１．２．１ 固相萃取纯化 取筛板置于６ ｍＬ萃取柱底端，分别称量１００ ｍｇ的硅胶Ｃ１８、ＰＳ／ＤＶＢ填充萃取柱，平铺填料后，在其上面放一个筛板。以一定序列的带ＤＭＴ保护基团的寡核苷酸（“Ｔｒｉｔｙｌ ｏｎ”形式）为试验样品，用３ ｍＬ ｐＨ ８的０．１ ｍｏｌ／Ｌ醋酸三乙胺（ＴＥＡＡｃ）溶液溶解样品，振匀后平均分成３份，分别使用Ｏａｓｉｓ ＨＬＢ固相萃取小柱、自组装的ＰＳ／ＤＶＢ和硅胶Ｃ１８萃取小柱纯化寡核苷酸，方法如下：将４ ｍＬ乙腈过柱，活化；用４ ｍＬ ｐＨ ８的０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＴＥＡＡｃ溶液进行柱平衡；上样，３～４ ｍｉｎ内样品在重力下通过吸附床，重复两次上样；用３ ｍＬ含体积分数为１４％的乙腈的ｐＨ ８的０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＴＥＡＡｃ溶液冲洗短链的寡核苷酸，重复一遍；用３ ｍＬ去离子水洗两遍；将３ ｍＬ体积分数为３％的三氟乙酸加入到填料上方，其在重力下过柱，控制旋钮，先流出１ ｍＬ的三氟乙酸，停３～５ ｍｉｎ，完成去ＤＭＴ保护基团过程，观察到吸附层变橙红色后再重复用３ ｍＬ的三氟乙酸过柱；用３ ｍＬ去离子水洗两遍；逐滴加入１ ｍＬ含体积分数为１０％的乙腈的ｐＨ １１．３的０．３６ ｍｏｌ／Ｌ ＴＥＡＡｃ溶液，控制流速为１～２ ｍＬ／ｍｉｎ，边洗脱边收集。定量，分装，干燥。